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猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染

作　者: 李宇立
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 Jiv90基因打靶载体 RNA干扰
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪瘟(Classic swine fever,CSF)是一种高度接触性传染病。猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)为有囊膜的单股正链RNA病毒,是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的重要成员。CSFV可以感染多种细胞,包括T细胞,高、低密度粒细胞,单核细胞,外周血白细胞,巨噬细胞和树突状细胞等。宿主细胞的分子伴侣Jiv基因(J-domain protein interacting with viral protein)是存在于宿主细胞中对CSFV在持续感染中具有一定的作用。此外,在已有的研究中也发现猪瘟病毒的3’-UTR在病毒感染中有着重要的作用。首先,依据Jiv90基因和CSFV感染的关系,本研究采取基因打靶技术以及近年来行之有效的正负筛选(PNS)基因打靶策略,根据Cre-Loxp系统的基因同源重组原理,构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪脐静脉血管内皮细胞(Swine Umbilical Vein Endothelial cells SUVEC)进行Jiv90基因敲除效果初步验证。其次,针对猪瘟病毒的3’-UTR的在病毒感染中所起到的重要作用,设计关于该区域的靶向3个位点的shRNA序列,采用RNA干扰方法进一步对CSFV的致病机制给予研究。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中公布的Jiv90序列设计引物,提取SUVEC全基因组DNA,克隆得到Jiv90核心区两侧的基因序列,作为打靶载体的同源长短臂。长短臂的基因片段分别为4522 bp和1944 bp。同源长短臂分别与载体pEASY-T1相连后,长臂经过HindⅢ单酶切和测序鉴定,短臂经过ClaⅠ和SpeⅠ双酶切和测序后,均符合置换型载体同源臂构建要求。(2)将Jiv90基因的同源长短臂与打靶骨架载体pA2T相连,成功构建了Jiv90基因敲除载体JKS。利用脂质体转染试剂将JKS载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选得到稳定转染的细胞株。其中筛选浓度G418为1500μg/mL,GANC为200 nmol/mL。(3)利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,并对筛选阳性细胞感染CSFV后利用实时定量PCR(Real-time PCR)检测该细胞病毒增殖情况。结果表明,转染JKS载体的细胞中猪瘟病毒核酸含量较之正常细胞降低了3.65倍左右,说明Jiv90基因的敲除可抑制细胞中猪瘟病毒的增殖。(4)设计靶向3个位点的shRNA序列。合成shRNA模板并连接至pGPU6/GFP/Neo载体,序列测定证明成功构建了针对CSFV 3’-UTR的3个位点的干扰载体。载体通过脂质体转染法转染PK-15和SIEC细胞。由G418抗性筛选获得干扰载体表达超过85%的阳性细胞,通过Real-time PCR确定Pig1载体具有良好的干扰效果。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
文献综述  13-24
  第一章基因打靶及RNA 干扰技术和转基因动物研究进展  13-22
    1.1 基因打靶技术简介  13-16
      1.1.1 基因打靶的原理  13
      1.1.2 打靶载体的应用简介  13-15
      1.1.3 几种提高重组效率的策略  15-16
    1.2 RNA 干扰技术简介  16-17
      1.2.1 RNA 干扰技术原理  16
      1.2.2 RNAi 的作用机制  16-17
      1.2.3 RNAi 技术在抗病毒研究中的应用  17
    1.3 转基因动物研究进展  17-22
      1.3.1 转基因动物概述  17-18
      1.3.2 动物转基因技术的简介与发展  18-20
      1.3.3 转基因技术在猪上的应用和发展  20-22
  第二章分子伴侣JIV90 基因及CSFV 3'-UTR 的功能  22-24
    2.1 猪瘟病毒简介  22
    2.2 JIV90 基因功能简介  22-23
    2.3 CSFV 3'-UTR 的功能  23-24
试验研究  24-53
  第三章分子伴侣JIV90 基因真核细胞打靶载体的构建  24-36
    3.1 材料  25-26
      3.1.1 材料和常用试剂  25
      3.1.2 主要仪器  25
      3.1.3 主要试剂的配制  25-26
    3.2 方法与步骤  26-30
      3.2.1 全基因组DNA 的制备  26
      3.2.2 打靶载体JKS 的构建  26-30
    3.3 试验结果  30-34
      3.3.1 猪Jiv90 基因同源臂的扩增及鉴定结果  30
      3.3.2 5'同源臂和3'同源臂的PCR 初次扩增结果  30-31
      3.3.3 具有酶切位点的5'同源臂和3'同源臂的PCR 扩增结果  31
      3.3.4 同源臂连接载体pEASY-T1 的酶切结果  31-32
      3.3.5 pA2Tpsp 重组质粒检测结果  32-33
      3.3.6 JKS 重组质粒检测结果  33
      3.3.7 打靶载体JKS 构建图  33-34
    3.4 讨论  34-35
    3.5 小结  35-36
  第四章打靶载体JKS 转染SUVEC  36-45
    4.1 材料  37-38
      4.1.1 病毒、载体和细胞转染相关试剂  37
      4.1.2 主要器材  37
      4.1.3 主要试剂的配制  37-38
    4.2 方法  38-40
      4.2.1 SUVEC 的传代培养  38
      4.2.2 SUVEC 的细胞冻存  38
      4.2.3 SUVEC 的细胞复苏  38
      4.2.4 SUVEC 的G418 最佳筛选浓度度确定  38
      4.2.5 打靶载体JKS 转染SUVEC 细胞  38-39
      4.2.6 基因整合PCR 检测  39
      4.2.7 转染JKS 载体细胞筛选后接毒试验  39
      4.2.8 总RNA 的提取及质量鉴定  39-40
      4.2.9 Real-time PCR 检测  40
    4.3 试验结果  40-43
      4.3.1 猪Jiv90 基因同源打靶载体JKS 转染细胞的结果  40-41
      4.3.2 转染后的neo 基因检测结果  41
      4.3.3 总RNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果  41-42
      4.3.4 接毒后细胞的实时定量PCR 检测结果  42-43
    4.4 讨论  43
    4.5 小结  43-45
  第五章针对CSFV 基因组3'-UTR SHRNA 细胞株筛选和病毒检测  45-53
    5.1 材料  45-46
      5.1.1 病毒、细胞和载体  45
      5.1.2 主要试剂  45
      5.1.3 仪器和器材  45-46
    5.2 方法与步骤  46-47
      5.2.1 针对3'-UTR 区基因的序列分析及三个靶点的shRNA 的化学合成  46
      5.2.2 骨架载体pGPU6/GFP/Neo  46
      5.2.3 针对CSFV 的3'-UTR 区的shRNA 的载体构建.  46
      5.2.4 干扰载体转染PK-15 细胞和SIEC 细胞.  46
      5.2.5 G418 筛选及阳性细胞的富集  46-47
      5.2.6 筛选细胞的接毒试验和Real-time PCR 检测  47
    5.3 结果  47-51
      5.3.1 干扰序列设计结果  47
      5.3.2 合成的DNA 序列  47
      5.3.3 干扰载体测序结果  47-49
      5.3.4 G418 筛选的最佳浓度和筛选细胞系结果  49-50
      5.3.5 Real-time PCR 检测结果  50-51
    5.4 讨论  51-52
    5.5 小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
作者简介  61

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染

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