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转录辅助因子PC4在非小细胞肺癌中的表达及其功能的实验研究

作　者: 彭毅
导　师: 史春梦; 粟永萍
学　校: 第三军医大学
专　业: 军事预防医学
关键词: 转录辅助因子PC4 非小细胞肺癌分子靶向治疗间充质干细胞细胞衰老 RNA干扰
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肺癌的死亡率在全球恶性肿瘤中居首位，成为恶性疾病中人类健康的头号杀手，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%。大多数NSCLC临床确诊时已经处于复发或转移的晚期阶段。作为标准一线治疗的含铂两药联合化疗方案进入一个平台期，5年生存率只有10～15%。分子靶向治疗为晚期NSCLC患者带来了希望，分子靶标的探索也成为近年来国内外研究恶性肿瘤治疗的热点。转录辅助因子PC4是一种进化过程中高度保守的转录调控蛋白，广泛存在于酵母、哺乳动物和人类细胞中。人类PC4是一个127aa组成的单链DNA结合蛋白，在基因表达转录、复制、DNA损伤修复、染色体形成等过程中均能发挥调控作用。已报道的PC4功能研究主要集中在DNA转录调控方面，该基因更多新的生物学功能还有待进一步研究，尤其是PC4在恶性肿瘤发生发展中的作用尚未完全阐明。本课题以NSCLC为研究对象，重点研究转录辅助因子PC4在NSCLC中的表达及其功能。通过RT-PCR、Western blot和免疫组化技术检测PC4在NSCLC临床样本中的表达特点，探讨其在NSCLC发生发展中的作用和意义；进一步通过Western blot筛选高表达PC4的NSCLC细胞株建立体外研究模型，采用RNA干扰技术下调PC4表达，检测NSCLC细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞代谢的变化特点，揭示其在NSCLC细胞中的功能及其作用机制；进而建立NSCLC细胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特异性siRNA混合脂质体瘤内注射，明确其对NSCLC细胞移植瘤生长的调控作用。此外，初步研究PC4在大鼠骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）体外衰老过程中表达的变化特点，探讨其在MSCs增殖和衰老中的调控作用。主要研究结果如下：1．对6例手术切除的NSCLC样品，通过RT-PCR和Western blot检测发现，PC4在NSCLC癌组织中的表达水平高于NSCLC癌旁组织。进一步收集104例NSCLC癌组织及癌旁组织的临床标本，通过免疫组化检测证实PC4在NSCLC癌组织中表达上调，且表达水平与NSCLC恶性程度及转移情况具有相关性，恶性程度越高的NSCLC中PC4的表达水平越高，有淋巴结转移或远处转移情况下NSCLC中PC4的表达水平高于无转移情况下NSCLC。2．对7种不同组织学类型的肺癌相关细胞株，通过Western blot筛选PC4高表达NSCLC细胞株，并建立A549、H460、H358三种细胞的体外研究模型。进一步通过RNAi下调PC4表达后发现，三种细胞增殖均受到抑制，细胞周期G1期阻滞，S期减少，同时发生不同程度的凋亡，以A549细胞凋亡效应最明显，流式细胞术检测发现A549细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧浓度、细胞内ATP浓度均明显降低，Western blot检测发现PCNA、Cyclin D1表达下调，p21表达上调，casepase-3表达被激活，PARP表达被剪切。3．建立A549细胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特异性siRNA混合脂质体治疗后发现，肿瘤生长受到抑制，肿瘤平均重量明显降低，镜下可见明显的肿瘤细胞坏死区，血管形成减少，Ki67表达降低，凋亡细胞增加，裸鼠平均体质量及主要脏器组织的镜下形态未发生明显的变化。4．大鼠骨髓来源的MSCs长期体外连续传代后出现细胞衰老，PC4在衰老细胞中表达降低。通过RNAi下调PC4表达后发现，MSCs增殖受到抑制，β-半乳糖苷酶染色阳性率增加。取得的主要结论包括：1．PC4在NSCLC中呈过表达状态，可能在NSCLC的发生、发展及转移中发挥作用，为NSCLC分子病理诊断提供了潜在的候选分子标志。2．下调PC4表达可抑制NSCLC细胞增殖，并诱导NSCLC细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞代谢水平降低，表明PC4在NSCLC细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞代谢的调控中发挥作用。3．PC4特异性siRNA混合脂质体治疗可抑制NSCLC细胞裸鼠移植瘤生长，且无明显的毒副作用。体外和体内研究表明，PC4可能是NSCLC分子靶向治疗的新的潜在靶点。4．下调PC4表达可抑制MSCs增殖，并诱导MSCs发生衰老，表明PC4在MSCs体外增殖和衰老过程的调控中发挥作用。

转录辅助因子PC4在非小细胞肺癌中的表达及其功能的实验研究

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