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Sox2、Pax6对ErbB家族基因调控机制的研究

作　者: 贾海涛
导　师: 白洁
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 生理学
关键词: Sox2 Pax6 ErbB 干细胞肿瘤干细胞
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：干细胞与肿瘤干细胞特性之间既有相同也有不同，其生物学行为都受到类似的内在基因调控和外在局部微环境的双重影响。转录因子和生长因子及其受体是这种双重调控的两个重要方面，研究它们之间的相互关系、并比较这种调控机制在正常干细胞与肿瘤干细胞之间的异同具有重要意义。表皮生长因子受体（Epithelial Growth FactorReceptor，EGFR）是正常神经干细胞增殖过程所必须的生长因子；它属于ErbB基因家族，有四个成员ErbB1（EGFR）、ErbB2（HER2）、ErbB3和ErbB4，EGFR和ErbB家族的其它成员不仅在干细胞中有表达，在肿瘤细胞中也也具有多种重要的生物学作用，但调控ErbB受体家族的转录因子仍然有许多未知，它们的表达调控机制在干细胞和肿瘤干细胞中又有哪些相同点和不同点也不清楚。本文将就调控ErbB家族受体的转录因子以及它们在正常干细胞与肿瘤干细胞之间的异同进行初步的研究。根据我们的前期工作，有两类转录因子可能对ErbB家族受体的转录调控起重要的作用。第一个是Sox基因（SRY related HMG-Box genes）家族，Sox基因是一类与干细胞的特性与细胞分化非常重要的转录因子。Sox2是干细胞的特异标志，参与干细胞增殖的调节和多项分化潜能的维持。我们在前期研究中发现，Sox2能够通过调节EGFR的mRNA转录表达影响神经干细胞的自我复制和增殖，因此，我们提出以下问题：（1）在肿瘤干细胞或肿瘤细胞及其他类型的干细胞中是否也存在Sox2调节EGFR的机制？（2）Sox2对ErbB家族各成员之间是否均存在类似的调控关系？第二个转录因子是Pax6（paired box6），Pax6是调节神经干细胞向神经元分化的关键转录因子，它和EGF-应答的神经干细胞的发育可能有直接的关系，那么，Pax6和EGF以及EGFR之间有什么调节关系呢？如果有，对神经干细胞的又起什么样的作用呢？进一步，在肿瘤干细胞，特别是神经系统的肿瘤干细胞的发生和发展过程中，是否也存在类似的机制呢？论文将分为两部分，第一部分：Sox2对ErbB家族基因调控机制的研究；第二部分：Pax6对EGFR基因调控机制的研究。下面也将分成两部分论述。第一部分：Sox2对ErbB家族基因调控机制的研究方法：体外包装Sox2表达质粒和重组腺病毒，以空载腺病毒和Sox10表达腺病毒为对照，转染乳腺癌MCF-7细胞系、神经胶质瘤U87细胞系和骨髓间充质干细胞（MSC）：利用Real-Time PCR方法检测ErbB基因家族各成员（EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4）、及肿瘤干细胞相关标志CD133，和神经胶质细胞标志（S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2）等基因mRNA转录水平变化；免疫荧光（Immunocytochemistry）和Western-blot分析蛋白表达水平的变化；双报告基因检测方法测定Sox2对ErbB家族基因的调控关系。结果：（1）转染Sox2过表达腺病毒到MCF-7细胞系中，ErbB2和ErbB3的mRNA转录水平明显增加，CD133-mRNA转录也有增加趋势，EGFR和ErbB4的mRNA转录未见明显变化；在U87细胞系和MSC细胞中转染Sox2过表达腺病毒后，EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、CD133、S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2等基因mRNA转录水平均未见到显著变化；Immunocytochemistry观察：在MCF-7细胞中转染Sox2过表达腺病毒，Sox2可分别与ErbB2和ErbB3出现共表达，Sox2蛋白在细胞核中表达，而ErbB2和ErbB3蛋白的表达主要集中在细胞膜，胞浆中少量表达，此外，在新增殖的MCF-7细胞中，ErbB2和ErbB3也有表达；Western blot分析：尽管在MCF-7细胞中Sox2和ErbB2都有本底水平的表达，但随Sox2表达增加，ErbB2的表达也明显增加，而转染空载腺病毒组和Sox10腺病毒组未见到这一变化；报告基因检测系统分析：Sox2上调ErbB2、ErbB3基因启动子区介导的荧光素酶表达活性，并且这种表达随Sox2质粒浓度的增加而增强。结论：在ErbB2和ErbB3基因启动子区存在Sox2的转录调控位点；Sox2可能直接上调MCF-7细胞中ErbB2、ErbB3受体的表达。第二部分：Pax6对EGFR基因调控机制的研究方法：（1）利用Pax6基因突变小鼠做为动物模型，解剖取出野生型（WT）和Pax6基因突变型（mutant）胎鼠的背侧皮层，在体外做神经干细胞克隆成球培养。用96孔板法进行克隆成球率实验，并比较两种神经球的EGFR的蛋白及mRNA表达水平的变化。（2）利用表达EGFR的腺病毒转染神经干细胞，观察其对神经干细胞的突起生长的影响。结果：（1）利用Pax6基因突变小鼠做为动物模型，研究发现：野生型（WT）和Pax6基因突变型（mutant）神经干细胞克隆球在大小形态上无明显差异，但Pax6基因突变型小鼠神经球克隆数比野生型小鼠少，EGFR-mRNA转录水平下降，蛋白表达降低；（2）EGFR腺病毒转染神经球后，神经干细胞的突起生长长度明显受到抑制，这种作用可被EGFR特异性抑制剂PD168393所阻断。结论：Pax6调控SVZ神经干细胞EGFR受体的表达，调节神经干细胞增殖；而EGFR受体过表达可能抑制神经干细胞分化，维持其多潜能状态。

全文目录

摘要  2-5
ABSTRACT  5-8
符号说明  8-10
第一部分 Sox2 对 ErbB 家族基因调控关系的研究  10-36
  前言  10-11
  材料和方法  11-28
  结果  28-33
  讨论  33-36
第二部分 Pax6 对 ErbB 家族基因调控关系的研究  36-45
  前言  36-38
  材料和方法  38-40
  结果  40-43
  讨论  43-45
结论  45-46
参考文献  46-50
综述  50-63
  综述参考文献  56-63
致谢  63-64
攻读硕士学位期间发表的学术论文  64-65
个人简历  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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