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LRP16对HeLa细胞的放化疗敏感性的影响及其机制

作　者: 段玉坤
导　师: 孟元光; 韩为东
学　校:
专　业: 妇产科
关键词: 辐射抵抗 放疗抵抗 LRP16 核转录因子-κB DNA损伤 单细胞凝胶电泳 肿瘤 凋亡
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


DNA损伤是对于细胞稳定性和基因完整性的主要威胁之一。细胞的损伤应答机制对于细胞的存活和防止肿瘤的形成非常重要。DNA损伤常涉及多种应答方式,包括有DNA损伤修复,细胞周期关卡,凋亡通路等。在各种DNA损伤形式中,DNA双链损伤(DNA double-strand breaks,DSB)最具细胞毒性作用,可由电离辐射(ionizing radiation, IR)、拓扑异构酶Ⅰ或Ⅱ的抑制剂,和代谢过程中形成的氧自由基等诱导发生。LRP16属于Macro domain家族蛋白成员之一,研究证实它与多种肿瘤细胞的放化疗抵抗有关。本室先前的结果证实内源性的LRP16与NF-κB的亚单位之一p65之间有相互作用,在TNF-α存在条件下,抑制LRP16内源性表达,可以显著抑制NF-κB的转录活性。我们主要研究在电离辐射(IR)和依托泊苷(ETO)诱导条件下,LRP16对细胞的放化疗抵抗的调控作用。方法：首先,通过单细胞凝胶电泳(SCGE)实验检测LRP16对于DNA损伤的作用,进一步采用流式细胞术检测γH2AX的表达水平来验证LRP16对DNA损伤的作用。之后分别通过CCK-8法和AnnexinV标记与流式细胞计数的方法检测了LRP16对细胞活力和凋亡的影响。最后通过RT-PCR法检测NF-KB下游靶基因的转录水平。结果：LRP16表达的增加下调了电离辐射和依托泊苷诱导的HeLa细胞损伤程度,抑制了DNA损伤修复；LRP16能够抑制IR和ETO诱导的细胞毒性作用；在抑制内源性LRP16的表达条件下,细胞的凋亡率显著增加；但过表达LRP16时,存在细胞种类差异,并且对不同损伤诱导因子作用下,对其凋亡率的影响也存在差异。通过RNA干扰技术沉默HeLa细胞中内源性LRP16的表达可以降低NF-κB的转录活性,下调了其下游凋亡相关靶基因。结论：本研究表明LRP16能增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗作用,这可能是通过调控NF-κB的转录活性来实现的。目的：研究LRP16基因的表达与HeLa细胞的DNA损伤程度的相关性方法：1.通过转染质粒pCDNA3.1-LRP16实现LRP16的过表达,蛋白印迹实验检测蛋白表达水平；2.用单细胞凝胶电泳法(SCGE),通过CASP软件分析OTM值和tail length两个指标；3.采用细胞流式技术检测各组细胞中γH2AX表达量。结果：1.蛋白印迹实验结果示：转染了pCDNA3.1-LRP16的HeLa细胞LRP16的表达量与空质粒pCDNA3.1相比明显增高；2.采用图像软件CASP分析SCGE结果：分别用IR或ETO处理细胞后,LRP16过表达组与空质粒相比,OTM值和tail length两个指标的值有统计学差异(p<0.05)3.流式细胞检测结果：分别用IR或ETO处理细胞后,LRP16过表达组与空质粒相比,超过预设荧光强度值的细胞数占总细胞数百分比差异显著(p<0.05)结论：外源性增加LRP16的表达量能够抑制电离辐射和依托泊苷诱导的DNA损伤,其机制是抑制了H2AX的磷酸化过程。目的：探讨LRP16对电离辐射或依托泊苷诱导的肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法：1.将抑制LRP16表达的小干扰RNA,control siRNA,siRNA-374,siRNA-668,分别转染入HeLa,H1299,MCF-7细胞内,并通过电离辐射或依托泊苷处理的细胞;用CCK-8检测细胞活力;用DAPI染色和流式细胞技术测定抑制LRP16的表达对HeLa细胞的凋亡率的影响；2.将转染了质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-LRP16的分别转染入HeLa,H1299,MCF-7细胞内,并通过电离辐射或依托泊苷处理的细胞；用CCK-8检测细胞活力；用流式细胞技术测定LRP16的表达对HeLa细胞的凋亡率的影响；3.通过RT-PCR检测抑制LRP16表达之后核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)凋亡相关的下游靶基因的mRNA水平。结果：在依托泊苷或者电离辐射的作用下,通过siRNA转染抑制LRP16的表达使能够明显抑制HeLa细胞的增殖(p<0.05)。同时增加细胞的凋亡率(p<0.05)；然而,在过表达组,LRP16对HeLa,H1299,MCF-7细胞的凋亡率的影响并不一致。在HeLa和MCF-7细胞中,LRP16对凋亡无影响(p>0.05)；在H1299细胞中,LRP16的表达的上调促进了细胞的凋亡(p<0.05)。结论：初步证实抑制LRP16增加肿瘤细胞对依托泊苷和电离辐射的敏感性,而且可能是通过下调NF-KB的转录活性来发挥放化疗抵抗效应。

全文目录


中文摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-17
  参考文献  14-17
第一部分：LRP16 对 HeLa 细胞 DNA 损伤的影响  17-40
  前言  17-21
  材料与方法  21-34
  结果与讨论  34-38
  参考文献  38-40
第二部分：LRP16 对 HeLa 细胞的增殖和凋亡的影响  40-54
  前言  40-42
  材料与方法  42-46
  结果与讨论  46-52
  参考文献  52-54
全文总结  54-55
综述  55-61
  参考文献  58-61
附加实验  61-66
  参考文献  64-66
中英文对照英文缩略语表  66-68
在读期间发表的论文  68-69
致谢  69-70

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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