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IL-1β调控小鼠胚胎着床机理的探讨

作　者: 刘萍
导　师: 郝翠芳
学　校: 滨州医学院
专　业: 妇产科
关键词: IL-1β 小鼠子宫内膜上皮细胞胚胎体外培养囊胚率孵出率 MMP-9 ICAM-1 lL一1Ra 着床
分类号: R714
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：建立小鼠胚胎着床模型,用不同浓度的IL-1β (interleukin-1betaβ)进行干预,通过观察小鼠胚胎发育、子宫内膜细胞及胚胎-子宫内膜共培养体系中MMP-9(matrix metalloproteinase-9)、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表达情况,探讨IL-1β调控小鼠胚胎着床的机理及最佳浓度。为IL-1β干预人类胚胎着床,提高临床妊娠率提供理论依据。方法：1.小鼠着床窗口期子宫内膜上皮细胞原代培养：昆明种雌性小白鼠孕D4取子宫内膜组织,剪碎后依次经100目、400目不锈钢筛网过滤。0.25%Ⅰ型胶原酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。2.小鼠子宫内膜上皮细胞鉴定：选取生长旺盛的细胞,分别在光学显微镜、倒置相差显微镜下观察子宫内膜上皮细胞形态,免疫组织化学技术鉴定细胞角蛋白表达。3.细胞免疫组织化学方法检测IL-1β对小鼠着床窗口期子宫内膜上皮细胞分泌MMP-9、ICAM-1的影响：取孕D4雌鼠,子宫内膜细胞原代培养24小时,加入不同浓度的IL-1β,设置空白对照组,检测MMP-9、ICAM-1蛋白在子宫内膜上皮细胞中的表达,并观察各实验组MMP-9、ICAM-1阳性细胞数量及表达水平的变化情况。采用IPP6.0高清晰彩色病理图文分析系统进行图像分析,每个组随机取5张片子,在200倍视野下每张片子选择5个不重复视野,由分析系统自动计数MMP-9、ICAM-1的阳性细胞,取其平均值；同时测定阳性细胞的积分光密度,取其平均光密度(OD)值。4.形态学方法观察不同浓度的IL-1β对小鼠胚胎体外发育的影响：收集孕鼠2-细胞胚胎,用含不同浓度IL-1β的培养液连续体外培养96小时,并设置空白对照组。观察培养72小时、96小时胚胎的囊胚率、孵出率的变化。5.ELISA方法检测不同浓度的IL-1β及IL-1Ra对胚胎与子宫内膜共培养体系分泌MMP-9、ICAM-1的影响：子宫内膜上皮细胞培养同前,收集孕鼠8-细胞胚胎,建立胚胎与子宫内膜共培养模型。用不同浓度的IL-1β及不同浓度的IL-1β+IL-1Ra干预共培养模型48小时,取上清液检测共培养体系MMP-9及ICAM-1蛋白的表达。结果：1.倒置相差显微镜下观察消化后的子宫内膜腺上皮细胞成团状。接种24h后已贴壁,培养48小时后细胞伸展融合成多角形铺路石样的单层细胞,排列紧密,细胞核较大,核位于细胞质中央。2.免疫组织化学染色,子宫内膜腺上皮细胞表达特异性角蛋白。角蛋白-18抗体染色阳性,胞质被染成棕色,细胞核呈蓝色,阳性率约96%。在对照组中,细胞质区域没有阳性反应。3.细胞免疫组化显示,着床窗口期子宫内膜上皮细胞经不同浓度IL-1β处理后,因蛋白表达量的不同,细胞质显示出深浅不同的棕黄色颗粒。各个实验组MMP-9、 ICAM-1蛋白表达量增加,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05)。4.形态学观察示,2-细胞胚胎体外培养,经含不同浓度的IL-1β培养液干预,培养72小时的囊胚率分别为：72.6%、71.4%、69.9%。明显高于对照组,有显著性差异(P<0.01)。lng/ml和10ng/ml组培养96小时的胚胎孵出率分别为：58.0%、58.4%,明显高于对照组,有显著性差异(P<0.05)。100ng/ml组的孵出率为42.9%。与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。5.ELISA方法检测结果显示,共培养体系经lng/ml、10ng/ml IL-1β干预后MMP-9、 ICAM-1蛋白表达上调,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05)；共培养体系经100ng/ml IL-1β干预后MMP-9、ICAM-1蛋白表达与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)；共培养体系经10ng/mlIL-1β+10ug/ml IL-1Ra干预后,MMP-9、ICAM-1蛋白表达下降,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05)；经lng/ml IL-1β+10ug/ml IL-1Ra,100ng/ml IL-1β+10ug/ml IL-1Ra干预后,MMP-9、ICAM-1的表达与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。结论：1.IL-1β可增加小鼠着床窗口期子宫内膜的容受性。2.IL-1β可促进体外培养2-细胞鼠胚的囊胚形成率及孵出率。3.IL-1β浓度在1-10ng/ml是小鼠胚胎体外培养较适宜浓度。4.IL-1β/IL-1Ra的适当比例可影响与着床相关蛋白的表达。5.IL-1β可能通过影响胚胎发育潜能及与着床相关蛋白MMP-9、ICAM-1的表达参与胚胎着床的调控。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-14
第一部分 IL-1β对小鼠着床窗口期子宫内膜容受性的影响  14-22
  1 材料  14-15
  2 方法  15-18
  3 结果  18-20
  4 讨论  20-21
  5 结论  21-22
第二部分 IL-1β对小鼠胚胎体外发育及着床的影响  22-33
  1 材料  22-23
  2 方法  23-27
  3 结果  27-29
  4 讨论  29-32
  5 结论  32-33
附图  33-36
参考文献  36-39
综述  39-46
  参考文献  43-46
攻读学位期间发表的学术论文  46-47
致谢  47

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