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昆白小鼠卵母细胞激活与孤雌胚体外发育

作　者: 何志全
导　师: 窦忠英
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 昆白小鼠孤雌激活孤雌生殖共培养子宫内膜上皮细胞
分类号: Q813.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

昆白小鼠是我国自主繁殖的近交系小鼠,由于其遗传背景清楚、生殖周期短、环境适应能力强等优点,是国内良好的实验动物模型。本研究以昆白小鼠为研究对象,分离了子宫内膜上皮细胞,对卵母细胞的孤雌激活、孤雌胚胎的发育潜能进行了研究,探讨了影响孤雌激活和发育的几个因素,为孤雌胚胎干细胞的分离、建系提供一些基础。主要内容有以下几点:1. 37℃下2.5 mg/mL胰蛋白酶+0.04%EDTA 30 min消化子宫内膜,结合刮取法,能获得活力高、数目多、细胞比较单一的子宫内膜上皮细胞,子宫内膜上皮细胞的活力随着细胞培养代数的增加而下降(噻唑蓝法检测)。2. 7%乙醇刺激小鼠卵母细胞,激活5～7 min时其激活效果及孤雌胚发育较好,其桑囊胚发育率可达29.77%;3. SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6～10 mmol/L为最佳处理浓度,3～6 h为最佳激活时间,其桑囊胚发育率可达16.67%。4.在复合激活中,7%乙醇激活5 min在联合2 mmol/L 6-DMAP +5μg/mLCB激活3 h效果最佳,其桑囊胚发育率高达35.77%。5.添加15%FBS的CZB和mM16培养液均能较好地支持2-cell胚胎发育到囊胚(27.2%,26.3%)。同时,添加FBS的CZB和mM16组的囊胚发育率也均显著高于相应的添加BSA组(p<0.01)。6. 15%FBS的CZB和mM16培养液进行孤雌胚培养时,胚胎在mM16培养液中仅有7.45%突破2-cell阻滞。但在CZB培养液中有41.66%能发育通过2-cell期并有29.17%到达桑囊胚。7.昆明小鼠MⅡ卵母细胞激活后在含15%FBS的CZB培养液中可较好地克服2-cell阻滞并形成桑囊胚。在培养48 h添加1.1 mg/mL葡萄糖对胚胎的继续发育有利。8.颗粒细胞、输卵管上皮细胞和小鼠子宫内膜上皮细胞与小鼠孤雌胚胎共培养24 h,共培养组胚胎与对照组大部分都能进行分裂。而从2-cell期进入4～8-cell期,CZB与颗粒细胞共培养组的胚胎发育无差异,但输卵管、子宫内膜上皮细胞共培养的胚胎要稍好一些(49.12%,48.23%)。CZB培养的桑囊胚发育率(32.99%)略低于其它三个共培养组的胚胎发育率(36.84%,38.71%,38.82%)(p<0.05)。因此,共培养细胞对孤雌胚的发育有一定的促进作用。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-13
第一章小鼠的饲养管理及卵母细胞激活培养  13-30
  1.1 小鼠的饲养管理及其影响因素  13-14
    1.1.1 一般饲养管理  13
    1.1.2 影响实验小鼠排卵的因素  13-14
  1.2 小鼠的诱导超排  14-16
    1.2.1 促性腺激素调控  14
    1.2.2 年龄及体重的影响  14
    1.2.3 促性腺激素的量  14-15
    1.2.4 促性腺注射时间  15
    1.2.5 小鼠品系  15
    1.2.6 小鼠腹腔内注射  15-16
  1.3 胚胎体外培养系统  16-19
    1.3.1 缓冲系统  16
    1.3.2 气相  16
    1.3.3 离子  16-17
    1.3.4 能量底物  17
    1.3.5 氨基酸  17
    1.3.6 生长因子  17-18
    1.3.7 蛋白质  18
    1.3.8 激素  18-19
    1.3.9 维生素  19
  1.4 卵母细胞激活的分子机理  19-22
    1.4.1 卵母细胞的体内发生  19
    1.4.2 卵母细胞中MPF 的水平  19-20
    1.4.3 激活机理  20-22
  1.5 卵母细胞孤雌激活方法  22-24
    1.5.1 电刺激激活  22-23
    1.5.2 乙醇和麻醉剂激活  23
    1.5.3 二价阳离子激活  23
    1.5.4 蛋白质合成抑制剂的激活  23-24
    1.5.5 钙离子载体A2318 的激活  24
    1.5.6 复合激活  24
    1.5.7 其他激活  24
  1.6 孤雌胚发育  24-28
    1.6.1 孤雌胚的核型  24-25
    1.6.2 孤雌胚的发育  25-26
      1.6.2.1 孤雌胚的体内发育  25-26
    1.6.3 雌性和雄性基因组在个体发育中的作用  26-27
    1.6.4 基因印记与胚胎发育的关系  27-28
  1.7 小鼠孤雌胚的研究意义及可能应用的前景  28-30
第二章不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果  30-38
  引言  30
  2.1 材料与方法  30-32
    2.1.1 实验材料  30-31
    2.1.2 实验方法  31-32
  2.2 结果与分析  32-35
    2.2.1 孤雌胚胎的体外发育  32-33
    2.2.2 7%的乙醇不同处理时间对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响  33
    2.2.3 SrC12 激活浓度及激活时间对卵母细胞孤雌激活的影响  33-34
    2.2.4 不同化学激活对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响  34-35
  2.3 讨论  35-37
    2.3.1 乙醇对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响  35-36
    2.3.2 SrC12 对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响  36
    2.3.3 各种化学激活对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响  36-37
  2.4 小结  37-38
第三章孕鼠子宫内膜上皮细胞的分离、培养及活力检测  38-45
  引言  38
  3.1 材料与方法  38-39
    3.1.1 材料  38
    3.1.2 方法  38-39
  3.2 结果与分析  39-43
    3.2.1 不同消化时间对子宫内膜的消化效果及对所获得的细胞的影响  39-40
    3.2.2 子宫内膜上皮细胞生长情况  40-42
    3.2.4 细胞活力检测  42-43
  3.3 讨论  43-45
    3.3.1 消化方法  43-44
    3.3.2 体外培养  44-45
第四章不同培养液对小鼠孤雌胚体外发育的影响  45-52
  引言  45
  4.1 材料与方法  45-47
    4.1.1 实验材料  45-46
    4.1.2 实验方法  46-47
  4.2 结果与分析  47-48
    4.2.1 不同培养液对小鼠孤雌胚胎发育的影响  47-48
    4.2.2 共培养系统对小鼠孤雌胚胎体外发育的作用  48
  4.3 讨论  48-51
    4.3.1 不同培养成分对小鼠孤雌胚胎发育的影响  48-50
    4.3.2 共培养细胞在小鼠孤雌胚胎发育中的作用  50-51
  4.4 小结  51-52
结论  52-53
参考文献  53-60
附表  60-61
致谢  61-62
作者简介  62

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