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RNAi介导的埃兹蛋白下调可抑制异位子宫内膜细胞的迁徙

作　者: 江桥英
导　师: 吴瑞瑾
学　校: 浙江大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子宫内膜异位症细胞迁徙埃兹蛋白下游信号分子 siRNA
分类号: R711.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄期妇女的常见病和多发病,严重影响着10%-15%的育龄妇女的健康,在不孕症患者中,内异症的发病率高达30%。然而,对于内异症的发病机制,虽然国内外学者进行了广泛的基础和临床研究,也已提出多种假说,如经血逆流种植学说、医源性及血液淋巴播散学说、体腔上皮化生学说、内分泌学说、免疫学说、遗传学说以及环境毒素学说等,但没有一种假说能够解释所有的内异症机理,故其发病机制仍未完全阐明。目前,人们较为广泛接受的是Sampson的种植学说及Meyer的组织化生学说,研究的热点也主要集中在子宫内膜细胞的转移及种植生长的分子及免疫机制。Ezrin是埃兹蛋白-跟连蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin,ERM)蛋白家族成员之一,为膜细胞骨架蛋白,主要分布于富含肌动蛋白纤维的细胞质膜下以及微绒毛、丝状伪足、尾足、膜皱折处和细胞接触粘连部位等细胞结构中,也可在分裂细胞的卵裂沟处表达。在肿瘤细胞中,Ezrin则弥散分布于胞浆和胞膜,提示Ezrin的亚细胞定位对于肿瘤的发生和侵袭扩散有重要意义。目前国内外各项研究显示,Ezrin的主要功能是通过调节皮质细胞骨架,参与形成细胞表面绒毛等特化结构及其形态的维持、细胞生长的调控、介导细胞信号的转导、调控肿瘤细胞的粘附、转移与侵润、参与细胞的吞噬与凋亡等。近年来,Ezrin在肿瘤细胞的粘附及迁移中的作用日益明确,其与妇科疾病的关系也日益受到学者们的关注。然而,综合国内外各项研究,Ezrin蛋白在子宫内膜异位症发病机制的研究尚少。在本研究中,我们首先利用real time RT-PCR技术检测Ezrin蛋白及其可能的下游信号分子RhoC/RhoA/ROCK1在卵巢型子宫内膜异位症患者的在位内膜、卵巢异位内膜及非子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜的mRNA表达水平,初步分析Ezrin在子宫内膜异位症发病机制中可能发挥的作用；然后通过卵巢型子宫内膜异位细胞的原代培养,利用siRNA干扰技术,下调Ezrin在异位子宫内膜细胞的表达水平,通过划痕试验验证Ezrin在异位子宫内膜细胞迁徙中的作用；最后利用Western Blot技术检测干扰前后其下游蛋白RhoC/RhoA/ROCK1的表达水平变化,初步验证Ezrin蛋白在子宫内膜异位症发病机制的信号转导通路。研究目的：检测Ezrin蛋白及其可能的下游分子RhoC/RhoA/ROCK1在子宫内膜患者及非子宫内膜异位症患者中的表达水平,利用相关试验技术初步探讨Ezrin蛋白在异位子宫内膜细胞迁徙及子宫内膜异位症发病中的作用。材料与方法：选择2010年5月至2010年12月在浙江大学医学院附属妇产科医院因子宫内膜异位症行手术治疗的Ⅲ-Ⅳ期(根据1985年美国生育学会修正的子宫内膜异位症分期标准r-SFS进行分期)卵巢型子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜(在位组)及卵巢异位囊肿囊壁(异位组)15例,平均年龄35.8岁,范围23-52岁；其中增生期9例,分泌期6例；同时收集同期非子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜(对照组)14例,平均年龄39.2岁,范围25-49岁；其中增生期9例,分泌期5例。利用real time RT-qPCR方法检测Ezrin/RhoA/RhoC/ROCK1在以上组织的表达水平；然后通过异位子宫内膜细胞的原代培养,利用siRNA干扰技术、细胞划痕技术及Western blot技术验证Ezrin蛋白在异位子宫内膜细胞迁移及子宫子宫内膜异位症发病机制中的作用。结果：1. Ezrin蛋白在异位子宫内膜的mRNA表达水平显著高于在位子宫内膜及非子宫内膜异位症患者的表达水平(P<0.05)。其各自的相对表达水平分别为0.428±0.187；0.272±0.105：0.194±0.066；2. RhoA在异位子宫内膜的在位子宫内膜及非子宫内膜异位症患者的mRNA表达水平分别为0.995±0.292；0.742±0.279；0.673±0.198,其中异位组显著高于在位组和对照组(P<0.05)；3,RhoC和ROCKl在异位组的表达水平也均显著高于在位组和对照组,差异具有显著性(P<0.005)；4, Ezrin. RhoA/RhoC/ROCK1mRNA表达在在位组与对照组子宫内膜中均无显著差异(P>0.05)；5、通过对异位子宫内膜细胞的原代培养及划痕试验发现,当Ezrin蛋白被siRNA显著下调后(Ezrin的蛋白平均干扰效率为66.35±11.99%),异位子宫内膜细胞的迁徙水平较对照组显著下降(转染48hr之后,较阴性对照组下降41.1%)；Western blot的结果显示,RhoA、RhoC及ROCK1的蛋白水平也出现相应下调,平均下调比例分别为42.68%,58.42%,59.88%。通过干扰组与阴性对照组比较,RhoC及ROCK1差异具有统计学意义(P<0.05),RhoA差异无显著性(P>0.05)。结论：1、Ezrin.RhoA.RhoC和ROCK1蛋白在异位子宫内膜中高表达。2、通过下调Ezrin蛋白的表达水平,可显著抑制异位子宫内膜细胞的迁徙。3、异位子宫内膜组织中高表达的Ezrin可能参与了子宫内膜异位症的发病,这种机制可能通过RhoC/ROCK1信号转导通路实现。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-11
缩略词表  11-13
1 引言  13-16
2 材料与方法  16-29
  2.1 研究对象  16-17
  2.2 实验方法  17-29
3 结果  29-36
  3.1 EZRIN、RHoA/RHOC/ROCK1 MRNA在异位及在位子宫内膜组织的表达水平  29-31
  3.2 异位子宫内膜细胞的原代培养  31-32
  3.3 荧光显微镜下观察细胞转染效率  32-33
  3.4 EZRIN基因的蛋白水平干扰效率  33
  3.5 干扰前后异位子宫内膜细胞迁徙能力的比较  33-35
  3.6 EZRIN干扰后其相关下游分子RHoA/RHoC/ROCK1蛋白表达水平变化  35-36
4 讨论  36-40
5 结论  40-41
参考文献  41-46
综述  46-56
  参考文献  53-56
作者简介及在读期间科研成果  56

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