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siRNA沉默脊髓D型氨基酸氧化酶对慢性疼痛的抑制作用

作　者: 陈晓玲
导　师: 王永祥
学　校: 上海交通大学
专　业: 药理学
关键词: siRNA 基因治疗 D型氨基酸氧化酶福尔马林疼痛模型慢性疼痛脊髓
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

D-型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)是一种以FAD为辅基的氧化酶,它在体内参与的生化反应为催化D-型氨基酸分解产生相应的α-酮酸、NH3和H2O2。先期研究通过基因敲除和化学抑制剂的方法先后证明DAAO在多种慢性疼痛中,可能发挥了作用。本研究为了进一步验证DAAO可以作为治疗慢性疼痛的靶点,选用特异性较强的RNA干扰的方法,进行如下探索:第一,利用计算机软件设计针对DAAO的siRNA及非特异序列siRNA(阴性对照)。我们构建并包装腺病毒作为基因转运载体。以shRNA作为siRNA的前体,利用其转染进入细胞体内,在Dicer酶的作用下生成siRNA。由于shRNA在结构上需存在一个反向的互补碱基序列,故在设计shRNA时,我们利用siRNA的碱基序列设计了一段它的互补结构,并用一个loop结构连接这两段RNA。根据我们利用分子克隆技术,在体外合成编码DAAO基因的shRNA核苷酸序列单链,退火形成shRNA双链之后,利用限制性内切酶技术将其克隆到真核表达载体pDC316-EGFP-U6中,委托第二军医大学的钱其军教授课题组包装为腺病毒。第二,用腺病毒转染NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)细胞,分别在24h和48h提取总RNA和蛋白质。RNA做RT反应获得cDNA,cDNA以GAPDH作为参照,进行Realtime PCR ,结果表明,实验组NRK-52E中的DAAO mRNA表达相对空白组和阴性对照组分别被抑制了51.7%和49.1%;DAAO蛋白以β-actin为参照,进行Western blot,DAAO蛋白表达相对空白组和阴性对照组分别被抑制了50.2% or 51.2%。确定了设计的该条有效的siRNA序列后,我们分别用腺病毒,PEI(Polyetherimide聚醚酰亚胺)为载体进行大鼠鞘内基因给药。连续给药7天后,我们通过皮下注射福尔马林溶液来建立慢性疼痛动物模型,测定大鼠福尔马林疼痛,并检测大鼠脊髓DAAO的沉默效果。结果显示:两种载体给药效果相当,大鼠福尔马林急性疼痛不受影响,而慢性疼痛抑制了约60%,用Real-time PCR和Western blot检测脊髓DAAO沉默效率约50%。我们又选用了骨癌痛模型,用PEI载体鞘内给药,测试了沉默大鼠脊髓DAAO后的足底痛阈变化。鞘内基因给药对骨癌痛抑制了约40%。另外,我们监测了骨癌痛给药的时效曲线,发现给药5天后开始出现镇痛作用,在第7天达到最大镇痛药效,继续给药不能增强镇痛效果。给药10天后镇痛作用逐渐降低,停止给药后第8天镇痛作用消失。该结果将对siRNA的基因治疗提供临床依据。沉默DAAO在骨癌痛实验中达到最大镇痛作用,即给药第10天时单次给药CBIO,非特异序列组(对照组)也出现40%的镇痛效果,而siRNA/ DAAO组(实验组)镇痛作用没有继续增强。结果说明CBIO对DAAO的抑制作用是特异性的,抑制脊髓DAAO对骨癌痛有40%的镇痛作用。第四,由于前期研究发现星形胶质细胞在疼痛状态中处于激活状态,DAAO大量存在于星形胶质细胞。我们测试DAAO沉默后星形胶质细胞的变化,发现随着DAAO沉默后表达降低,星型胶质细胞的生物标记物GFAP(glial fibrillary acidic portein胶质纤维酸性蛋白)的表达也降低。说明星形胶质细胞的激活受到抑制。DAAO参与疼痛过程可能与星形胶质细胞的状态有关。综上,我们用siRNA基因沉默的方法进一步证明了DAAO是慢性疼痛的潜在靶点,并推测DAAO参与疼痛过程可能与星形胶质细胞的状态有关。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
第一章绪论  11-26
  1 慢性疼痛及其研究现状  11-12
    1.1 慢性疼痛  11
    1.2 慢性疼痛研究现状  11-12
  2.D 型氨基酸氧化酶与慢性疼痛  12-18
    2.1 D型氨基酸氧化酶  12-15
    2.2 D型氨基酸氧化酶疼痛方面的前期研究  15-18
  3.RNA干扰  18-22
    3.1 RNA干扰介绍  18-20
    3.2 基因导入方法  20-22
      3.2.1 病毒载体  20-22
      3.2.2 非病毒载体  22
  4.RNA干扰用于慢性疼痛治疗的研究  22-24
  5 研究内容和研究意义  24-26
第二章材料与方法  26-38
  1 实验材料  26-27
    1.1 细胞株  26
    1.2 主要药品和试剂  26
    1.3 动物  26-27
    1.4 主要实验仪器  27
  2 实验方法  27-38
    2.1 siRNA和shRNA的设计与合成  27-30
      2.1.1 siRNA设计与合成  27-28
      2.1.2 shRNA设计与合成  28-29
      2.1.3 腺病毒载体的构建与包装  29-30
    2.2 腺病毒转染NRK-52E 细胞  30
      2.2.1 六孔板铺板  30
      2.2.2 转染  30
    2.3 PEI/siRNA 复合物的制备  30-31
    2.4 实时定量PCR和Western blot  31-34
      2.4.1 荧光定量PCR  31-32
        2.4.1.1 细胞总RNA的提取  31
        2.4.1.2 RT反应  31
        2.4.1.3 DAAO 基因 cDNA PCR 条件的确定  31
        2.4.1.4 Real-time PCR  31-32
      2.4.2 Western blot  32-34
        2.4.2.1 细胞中蛋白质的提取  32
        2.4.2.2 Western Blot  32-34
    2.5 酮酸法测DAAO酶活  34
    2.6 脊髓蛛网膜下腔插管  34-35
    2.7 脊髓给药  35
    2.8 大鼠福尔马林致痛模型  35-36
    2.9 大鼠骨癌痛模型  36
    2.10 机械缩足反射阈(Mechanical withdrawal threshold, MWT)测定  36-37
    2.12 实验数据统计与分析  37-38
第三章实验结果  38-53
  1.R eal-time PCR 条件验证  38-41
    1.1 凝胶电泳检测全RNA提取效率  38
    1.2 实时荧光定量PCR产物特异性  38-41
  2.A d-shDAAO对大鼠肾上皮小管细胞NRK-52E中DAAO蛋白的沉默作用  41-44
    2.1 转染效率的检测  41
    2.2 Real-time PCR检测Ad-shDAAO腺病毒转染后NRK-52E细胞中DAAO mRNA表达降低  41-44
      2.2.1 实时荧光定量PCR检测腺病毒转染后NRK-52E细胞DAAO mRNA表达的改变-  41-42
      2.2.2 Western blotting检测Ad-shDAAO腺病毒转染后NRK-52E细胞中DAAO 蛋白表达降低  42-44
  3 鞘内注射shRNA对大鼠福尔马林疼痛的作用  44-46
  4 鞘内注射siRNA对大鼠福尔马林疼痛的作用  46-48
  5 鞘内注射siRNA对大鼠骨癌疼痛的作用  48-50
  6 沉默脊髓DAAO后神经胶质细胞的状态变化  50-53
第四章讨论  53-57
第五章总结与展望  57-60
  1 总结  57
  2 展望  57-60
参考文献  60-69
致谢  69-70
已发表文章  70-72

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