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慢病毒介导的HPV16型E6-shRNA对宫颈癌细胞的影响

作　者: 白垚
导　师: 叶彬
学　校: 重庆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 慢病毒 RNA干扰 人乳头瘤病毒 宫颈癌
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


人乳头瘤病毒（human papilloma virus HPV）的感染是引发宫颈癌的主要原因。HPV的E6和E7基因的整合和持续表达是HPV致癌的主要环节，也是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。90%以上的宫颈癌细胞中都可检测到HPV-DNA的存在，其中大部分为HPV16型和18型。由于宫颈癌细胞中整合的E6和E7基因与人体自身基因无同源性，可以成为理想的生物治疗靶标。因此，阻断细胞内整合型E6的表达不仅有利于进一步阐明宫颈癌的发病机制，而且在宫颈癌的生物治疗方面有潜在的应用前景。目前阻断细胞内整合型E6的表达主要使用反义核酸和靶向性核酶技术，但这两种方法的抑制效率不高,而且不能体内使用。近年来RNA干扰技术的兴起为此带来了新的契机。RNA干扰技术是通过双链RNA来阻断目的基因的表达，使用经细胞内转录后形成的发夹状短链干扰RNA（small hairpin RNA，shRNA），抑制靶基因的持续时间可达7天以上。慢病毒的感染效率高、激发免疫反应的作用弱，是携带干扰RNA理想载体。目前以慢病毒为载体的shRNA抑制宫颈癌细胞中E6的表达尚未见文献报道，因此我们设计了三条靶向HPV16E6的shRNA表达序列，将其克隆到慢病毒工作质粒PLL3.7中并经酶切和测序鉴定。PLL3.7与三种混合包装质粒以lipofectamine2000包裹后转染293FT细胞，由此产生shRNA重组慢病毒。以慢病毒感染宫颈癌Caski细胞后，检测癌细胞中HPV16E6表达的变化，与E6致癌相关基因P21和P53表达的变化；观察细胞增殖能力和侵袭能力的变化。研究结果如下。1.293FT细胞包装出的慢病毒滴度为5×106TU/ml。2.慢病毒感染后，Caski细胞中HPV16E6mRNA的含量下降80%，E6蛋白的表达下降65%；同时细胞中P53和P21蛋白表达水平明显上升，约为对照组的2.5倍。3. shRNA作用于Caski细胞7天后，细胞增殖能力下降：实验组仅为对照组细胞数的45%；细胞侵袭力也下降：实验组穿膜细胞比对照组减少65%。由于受包装系统效率的限制，一般逆转录病毒原液的滴度只有105TU/ml。本实验发现：慢病毒原液的滴度在106TU/ml以上；无义慢病毒感染前后Caski细胞的形态和增殖能力无明显变化。结果提示：增加慢病毒用量对宫颈癌Caski细胞无明显毒性，却能显著提高靶细胞的感染率。慢病毒原液滴度高，具有良好的实用性，是将目标基因导入宫颈癌细胞较理想的载体。HPV E6蛋白结合P53并通过泛素途径使其降解是细胞恶性转化的关键步骤之一。处于稳定期的细胞DNA受到损伤时，P53数量的增加使细胞停止于G1期，使损伤的DNA在复制之前得以修复。P53能激活WAF基因，WAF基因产物P21可与Cdk家族的激酶结合并抑制其活性，使细胞周期停止。P53失活后对细胞增殖周期相关因子P21、PCNA、Cyclins、Cdks的调节作用丧失，细胞中DNA损伤积累造成细胞癌变。我们的研究表明：慢病毒感染Caski细胞后，能将shRNA表达序列整合到细胞基因组中，转录形成的shRNA能阻断HPV16E6的表达，蛋白抑制率在65%以上；在HPV16E6表达下降后，其对P53的抑制作用被解除，细胞中P53蛋白的含量升高，P21蛋白的表达也升高。结果提示：我们构建的shRNA重组慢病毒能高效地抑制癌细胞内HPV16E6的表达，这为深入研究E6致癌的下游信号转导提供了良好的工具。HPV E6蛋白的持续表达是宫颈癌细胞维持恶性表型的关键因素之一。本课题研究发现：抑制E6蛋白的表达后，宫颈癌Caski细胞的增殖能力下降，细胞的倍增时延长；穿透transwell膜的细胞数目减少，这代表细胞的侵袭能力下降，提示阻断细胞中E6的表达可明显降低癌细胞的恶性表型；慢病毒介导的shRNA在宫颈癌生物治疗方面具有潜在的应用价值。综上所述，本课题成功构建了能高效抑制细胞中整合型E6表达的shRNA重组慢病毒，为进一步研究E6致癌的下游机制打下了良好的基础。慢病毒整合到细胞后，其持续产生的shRNA能有效抑制宫颈癌细胞的增殖能力和侵袭能力，具有潜在的应用前景。

全文目录


符号说明  5-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-15
第一部分 靶向 HPV16 E6-shRNA 慢病毒的构建及鉴定  15-30
  1 主要材料和试剂  15-17
  2 研究方法  17-23
  3 结果  23-27
  4 讨论  27-29
  5 结论  29-30
第二部分 慢病毒介导的 shRNA 对宫颈癌 Caski 细胞中 HPV16 E6 表达和细胞生长的抑制作用  30-45
  1 主要材料和试剂  30-32
  2 研究方法  32-37
  3 结果  37-41
  4 讨论  41-44
  5 结论  44-45
全文总结  45-46
参考文献  46-50
文献综述 HPV 与宫颈癌的发病机制及生物治疗  50-64
  参考文献  58-64
致谢  64-65
研究生期间发表及待发表的论文  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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