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干预供肝CIITA与MyD88基因表达抑制大鼠肝移植排斥反应的实验研究

作　者: 胡凡果
导　师: 刘彤
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: RNA干扰 纳米载体 CⅡTA MHC-ⅡMyD88 肝移植 移植排斥反应
分类号: R657.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分纳米载体HGPAEs的制备及检测目的：制备纳米载体组氮酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs)并观察其体内应用的安全性与有效性。方法：制备纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs),并对其进行性能测试；设置生理盐水组、纳米载体组和纳米载体质粒组,经门静脉注射体内转染大鼠肝脏,采取转染后第一天和第三天肝脏标本和静脉血,应用全波长酶标仪检测方法评价体内肝脏转染效果,并检测大鼠肝肾功能变化。结果：成功制备了纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs),经验证其具有作为基因载体的必备条件；第一天和第三天纳米载体质粒组的增强型绿荧光蛋白荧光强度均显著强于生理盐水对照组和纳米载体组(P<0.01),纳米载体质粒组第三天荧光强度强于第一天(P<0.01)；转染术后第一天,与正常值比较,各组ALT、AST均显著升高(P<0.01),但各组间比较无明显差异(P>0.05),转染术后第三天,各组生化指标均趋于正常。结论：纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)制备简便,是一种安全高效的基因载体；以纳米载体为介导经门静脉注射的方法可使shRNA质粒在体内肝脏获得高效转染。第二部分纳米载体介导沉默基因CⅡTA和MyD88表达的体内研究目的：观察RNA干扰对免疫识别相关基因CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88表达的抑制效果。方法：设置生理盐水对照组、纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组、纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组三个干预组,通过门静脉注射方法体内转染大鼠肝脏,转染后第三天取肝脏,以荧光定量PCR(?)western blot分别检测肝脏转染后CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因mRNA和蛋白水平的表达变化。结果：荧光实时定量PCR和western blot检测显示纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组CⅡTA和MHC Ⅱ基因mRNA和蛋白表达均较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组显著降低(P<0.01)；纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-pMyD88-shRNA组MyD88基因]mnRNA和蛋白表达较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组也有显著降低(P<0.01)；而纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组与生理盐水组之间CⅡTA、MHCⅡ和MyD88基因无论mRNA还是蛋白表达均无显著性差异(P>0.05)。结论：以纳米载体(HGPAEs)为介导经门静脉注射的方法,应用针对CⅡTA和MyD88的shRNA质粒转染大鼠肝脏,可显著抑制肝脏CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因表达。第三部分干预供体移植物抑制大鼠肝移植排斥反应的研究目的：观察抑制供体肝脏CⅡTA和MyD88基因的表达对高应答大鼠原位肝移植模型移植排斥反应的影响,探讨其抗排斥机制。方法：建立高应答大鼠原位肝移植模型；设置生理盐水组、纳米载体组、pHK-shRNA纳米载体组、纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组,各组采用经门静脉注射的方法干预供体大鼠肝脏,干预后3天取肝脏进行肝移植,每组各12只大鼠,于移植术后第5天随机选取6只大鼠取静脉血和移植肝脏,病理切片确定排斥反应分级,分别采用荧光定量PCR和western blot检测肝中CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,流式细胞术检测血中CD4/CD8细胞比例,ELISA去检测血清IL-2和IFN-γ浓度,并检测肝功能,其余6只用于观察存活期。结果：稳定建立高应答大鼠原位肝移植模型；与生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组.相比,纳米载体pCⅡTA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-pMyD88-shRNA组大鼠存活时间明显延长(中位生存期16天、14天和21天vs10天、9天和8天,P<0.01),排斥反应病理分级明显降低(P<O.01), CⅡTA、 MHC-Ⅱ和MyD88的mRNA转录水平和蛋白表达量均明显降低(P<O.01),血液CD4/CD8细胞比例显著降低(P<0.01),血清IL-2和IFN-γ浓度显著降低(P<0.01),AST、ALT和TBIL也显著降低(P<0.01)。结论：高应答大鼠原位肝移植模型是研究肝移植排斥反应的理想动物模型；采用纳米载体介导经门静脉注射针对CIITA和MyD88基因的shRNA质粒的方法干预供体移植物可明显减轻肝移植排斥反应,延长存活时间,为移植排斥研究和临床治疗提供了新思路。

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