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重组人促红细胞生成素（rhu-EPO）对腰脊神经节神经元保护作用的实验研究

作　者: 白占强
导　师: 娄朝晖
学　校: 郑州大学
专　业: 骨科学
关键词: 坐骨神经脊神经节细胞细胞凋亡神经营养因子重组人促红细胞生成素
分类号: R651.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

促红细胞生成素(EPO)是一种含唾液酸的酸性糖蛋白,具有水溶性,由165个氨基酸构成。主要来源于肾脏及胎肝,具有调节血细胞生成和分化功能的细胞因子；刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落,仅作用于骨髓的巨核前体细胞。EPO通过相应靶细胞膜表面受体介导后发挥生物作用。近年来的研究发现促红细胞生成素(EPO)具有明显的神经保护,神经营养和促进神经生长发育的重要作用,是一种新型的多功能神经保护剂。脊神经节为感觉神经胞体聚集区,由假单极神经元构成与肢体感觉功能有直接的关系。腰脊神经节损伤的修复,一直是医学界感到十分棘手的问题,周围神经损伤后如何促进周围神经损伤的修复及其再生、提高神经功能,一直是基础和临床研究目标。本实验旨在阐述实验性rhu-EPO (重组人促红细胞生成素)在促进腰脊神经节损伤修复中的作用,为临床促进周围神经系统功能恢复提供新的治疗方法,为外源性重组人促红细胞生成素治疗腰脊神经节损伤提供理论依据。方法：健康SD大鼠45只,体重200～250g,雌雄不拘,随机分为假手术组,对照组和rhu-EPO治疗组,每组15只。假手术组只暴露坐骨神经；对照组于梨状肌下10mm离断坐骨神经任其回缩后逐层缝合,每天皮下注射与治疗组相同剂量的生理盐水；rhu-EPO治疗组离断坐骨神经任其回缩并后每天皮下注射rhu-EPO(重组人促红细胞生成素)3000IU／kg治疗量。分别于术后1周、2周、3周经左心室向升主动脉插管灌注固定后,沿坐骨神经向椎间孔方向逆行追踪,撬开椎板,即可以确定脊神经根及膨大的脊神经节。取脊神经节标本行一般观察,甲苯胺兰染色、苏木精-伊红染色观察神经元的病理形态改变、局部炎症反应程度及Caspase-3染色细胞阳性率测定,检测细胞凋亡情况。结果：大鼠坐骨神经离断后,术侧下肢运动功能丧失,跛行明显,1周内出现足趾红肿,散开；出现皮肤变薄、光滑等失神经营养现象,上述现象呈逐渐加重趋势；第2周内出现足部溃疡并有清亮渗液,出现大鼠啃食自己足趾现象,部分足趾缺失；3周时出现足部溃疡加重并清亮渗液,大鼠足趾连同小腿远端缺失,局部肌肉萎缩,足趾红肿明显；术后2周、3周取材并观察rhu-EPO治疗组见近端新生神经直径较对照组粗大。rhu-EPO治疗组大鼠的足部病变与对照组比较,大鼠足部溃疡较对照组有轻微减轻现象,也有部分足趾缺失,无明显改善。1.尼氏体染色假手术组神经元染色深,轮廓清楚,胞体内充满细砂粒状尼氏体；坐骨神经切断后,对照组脊神经节神经元亦深染,部分神经元染色明显变淡,与假手术组相比细胞数量明显减少,轮廓不清楚；而rhu-EPO治疗组脊神经节神经元染色稍淡于假手术组,1周时脊神经节神经元病理改变明显,2周、3周时脊神经节神经元病理改变较对照组有显著改善,神经元数量较对照组增多。2.HE染色观察除假手术组无异常外,对照组脊神经节神经元细胞体广泛水肿,空泡样改变明显,神经元数量也减少,染色较淡。偶见个别典型凋亡神经元细胞孤立存在,呈固缩状态,胞浆浓缩、胞核皱缩、核染色质密度增高浓缩成密集颗粒状,凝聚在核膜周边,轴突不明显,但胞膜完整,胞浆呈橘红色明显深染,胞体体积收缩变形,细胞周围有空晕存在,术后1周、2周、3周随时间推移上述现象逐渐明显,损伤程度加重；rhu-EPO治疗组脊神经节神经元细胞体水肿程度较对照组减轻,1周时神经元胞体水肿、收缩变形、胞体周围空晕明显、偶见凋亡细胞,2周、3周后水肿及空泡样改变较前明显减轻,神经元染色较深,阳性细胞计数减少。3. Caspase-3检测结果对照组caspase-3免疫组织化学阳性细胞染色检测结果显示为棕黄色,阳性细胞表达以神经胶质细胞为主,脊神经节神经元胞体亦可见阳性表达细胞。假手术组未见或仅见少量阳性细胞。rhu-EPO治疗组casepase-3阳性细胞表达数显著低于对照组(P<0.05),染色变淡。rhu-EPO治疗1周时阳性率较高,细胞凋亡明显,2周时阳性表达细胞减少有显著性差异,3周时仅见少量阳性细胞,染色较浅；对照组染色较深,caspase-3阳性细胞数随时间推移逐渐增高,表明损伤加重,rhu-EPO能够抑制脊神经节神经元细胞题凋亡,促进神经功能恢复结论：1.进一步证实坐骨神经离断后,可引起脊神经节神经元细胞体的损伤性反应；1周时为细胞凋亡高峰期,可以检测到不同阶段的凋亡细胞和典型凋亡小体。2.重组人促红细胞生成素具有重要的神经营养性作用,能够抑制腰脊神经节神经元细胞凋亡,促进神经功能恢复。3.提示了在周围神经损伤后早期应用促红细胞生成素对神经系统功能恢复至关重要。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-13
前言  13-16
1, 实验材料  16-17
  1.1 实验动物  16
  1.2 主要试剂  16
  1.3 主要仪器设备  16-17
2, 试验方法  17-20
  2.1 动物分组  17
  2.2 动物模型制备  17
  2.3 取材  17-18
  2.4 观察标准  18-19
    2.4.1 HE染色(苏木素-伊红染色)  18
    2.4.2 尼氏体染色(甲苯胺兰染色)  18
    2.4.3 Caspase-3(免疫组织化学检测)  18-19
  2.5 质量控制  19
  2.6 统计处理  19-20
3, 实验结论  20-24
  3.1 一般观察  20
  3.2 尼氏体染色观察结果  20-21
  3.3 HE染色观察结果  21
  3.4 Caspase-3检测结果  21-24
4, 讨论  24-27
  4.1 腰脊神经节损伤动物模型的建立及分组  24-25
  4.2 rhu-EPO(重组人促红细胞生成素)的神经保护作用及其可能机制  25
  4.3 细胞凋亡研究方法意义  25-27
5, 小结  27-28
6, 附图  28-33
7, 参考文献  33-35
综述  35-50
  参考文献  46-50
致谢  50-51
个人简历及在学期间发表论文  51

重组人促红细胞生成素（rhu-EPO）对腰脊神经节神经元保护作用的实验研究

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