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RNA干扰抑制bcr/abl融合蛋白表达及其对慢性白血病细胞K562的影响

作　者: 张雪涛
导　师: 郝新宝; 曹献英
学　校: 海南大学
专　业: 生物化工
关键词: 慢性粒细胞白血病 RNA干扰 bcr/abl融合基因 p210bcr/abl融合蛋白
分类号: R733.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本文中我们检测体外化学合成的小干扰RNA对慢性粒细胞白血病细胞系K562的影响,以及对融合蛋白表达量的影响。构建慢病毒表达载体,为后续研究以及临床治疗提供依据。利用阳离子脂质体转染细胞,并用MTT法检转染后的细胞活性,绘制生长曲线。利用软琼脂集落形成实验定量分析细胞的克隆形成能力。用Annexin-V-FITC法检测细胞凋亡水平。用western blot检测p210bcr/abl融合蛋白表达水平的变化。利用倒置荧光显微镜检测病毒是否包装成功。siRNA转染的最适浓度为100nM。使用合适的转染试剂,转染率可达50%。转染后48h, anti-1和anti-4oligo可使实验组细胞活力降低至阴性对照组的56.5%和57.2%。转染后72h, anti-1、anti-4和阴性对照组的细胞早期凋亡率为8.08%、14.18%和4.19%,晚期凋亡以及死亡率为15.48%、9.88%和2.13%。转染后48h,与阴性对照组相比,anti-1和anti-4组的p210蛋白表达量下降。在293细胞中包装携带shRNA的慢病毒载体,转染质粒72小时后可见70%的细胞带有绿色荧光。小干扰RNA可有效降低K562细胞活性,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,阻碍细胞克隆形成并降低p210融合蛋白表达水平,为RNAi治疗慢性粒细胞白血病提供了理论依据。慢病毒载体的成功构建,为本课题搭建了研究平台,提供了新的研究手段。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
1 绪论  9-17
  1.1 慢性粒细胞白血病简介  9-10
  1.2 RNA干扰技术简介  10-12
  1.3 应用RNAi技术治疗CML的研究现状  12-13
  1.4 存在的问题及前景展望  13-15
    1.4.1 转染方法和转染效率问题  13-14
    1.4.2 安全性问题  14-15
    1.4.3 RNAi应用于临床的前景展望  15
  1.5 研究思路  15-17
2 siRNA转染方法的建立及细胞增殖实验  17-26
  2.1 引言  17
  2.2 实验材料与仪器  17-20
    2.2.1 主要试剂来源及配制  17-19
    2.2.2 主要仪器和设备  19-20
  2.3 实验方法  20-22
    2.3.1 细胞培养  20
    2.3.2 细胞计数  20-21
    2.3.3 siRNA脂质体转染  21
    2.3.4 细胞增殖能力检测  21-22
  2.4 结果  22-25
    2.4.1 细胞培养  22
    2.4.2 不同转染试剂效果的比较  22
    2.4.3 细胞增殖能力检测  22-25
  2.5 讨论  25-26
3 细胞凋亡检测及克隆形成实验  26-33
  3.1 引言  26
  3.2 实验材料与仪器  26
    3.2.1 主要试剂来源及配制  26
    3.2.2 主要仪器和设备  26
  3.3 实验方法  26-27
    3.3.1 细胞凋亡检测  26-27
    3.3.2 细胞克隆形成  27
  3.4 结果  27-32
    3.4.1 K562转染后的凋亡  27-28
    3.4.2 K562转染后克隆形成  28-32
  3.5 讨论  32-33
4 bcr/abl融合蛋白p210bcr/abl表达水平的检测  33-40
  4.1 引言  33
  4.2 实验材料与仪器  33-35
    4.2.1 主要试剂来源及配制  33-35
    4.2.2 主要仪器和设备  35
  4.3 实验方法  35-37
    4.3.1 蛋白质提取  35
    4.3.2 BCA法测定蛋白质浓度  35-36
    4.3.3 Western blot步骤  36-37
  4.4 结果  37-39
    4.4.1 绘制蛋白浓度标准曲线  37
    4.4.2 p210~(bcr/abl)蛋白表达抑制  37-39
  4.5 讨论  39-40
5 构建慢病毒载体  40-47
  5.1 引言  40
  5.2 实验材料与仪器  40-43
    5.2.1 主要试剂来源及配制  40-41
    5.2.2 主要仪器和设备  41-43
  5.3 实验方法  43-44
    5.3.1 制备大肠杆菌感受态细胞  43
    5.3.2 热激法转化感受态  43
    5.3.3 抽提质粒  43
    5.3.4 琼脂糖凝胶电泳  43-44
    5.3.5 包装慢病毒  44
  5.4 结果  44-46
    5.4.1 质粒制备  44
    5.4.2 病毒包装  44-46
  5.5 讨论  46-47
6 结论与展望  47-49
  6.1 全文总结  47
  6.2 工作展望  47-49
参考文献  49-54
致谢  54-55
硕士期间发表的论文  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 慢性白血病
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