学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

FoxO1对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗的影响及机制研究

作　者: 饶小娟
导　师: 秦贵军
学　校: 郑州大学
专　业: 内分泌科
关键词: 胰岛素抵抗 FoxO1 RNA干扰 胰岛素受体底物-2
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 68次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


背景与目的胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是2型糖尿病（Diabetes mellitus,DM）发病机制中的一个重要因素,并且是肥胖,血脂异常,高血压,冠心病等代谢综合征的一个重要特征。因此IR一直是人们研究的热点。近年来,IR的发病机制,尤其是胰岛素信号转导异常在IR发生中的作用受到极大关注。叉头状转录因子O1（forkhead transcription factor O1,FoxO1）属于Fox转录因子O亚家族,是细胞内能量代谢的重要调节因子,同时也是胰岛素/胰岛素样生长因子-1（insulin/insulin-like growth factor 1,INS/IGF-1）信号通路中的关键分子。研究发现:FoxO1表达升高可上调糖异生途径关键酶的表达,影响肝脏葡萄糖输出;抑制糖尿病小鼠Foxo1基因表达后,发现其血糖水平显著下降,且肝脏组织糖异生途径关键酶的表达水平降低。以上研究表明FoxO1表达异常与IR有重要关系。但目前关于FoxO1与IR关系的研究尚少,抑制FoxO1表达能否改善IR及其详细机制尚不明确。胰岛素受体底物-2（insulin receptor substrate-2,IRS-2）是肝脏内的主要胰岛素受体底物（insulin receptor substrate,IRS）亚型,在胰岛素促进肝糖原合成,抑制糖异生和肝糖输出的信号转导中,IRS-2是重要信号分子,其表达异常可致肝脏IR。最近研究表明:通过转基因技术在大鼠肝脏增强FoxO1表达,饥饿状态时,表达增强FoxO1可通过反馈机制促进的IRS-2基因表达。然而,胰岛素抵抗状态时,抑制FoxO1基因表达对IRS-2表达的影响尚不清楚,关于两者关系的研究尚未见报道。本研究通过高浓度胰岛素诱导构建IR细胞模型,运用RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术抑制IR细胞中FoxO1基因表达,在此基础上使用葡萄糖氧化酶法检测糖的利用,采用免疫沉淀和western bolt技术检测IRS-2蛋白表达及酪氨酸磷酸化水平;旨在探讨抑制FoxO1基因表达对IR细胞葡萄糖利用的影响及可能机制,为研究FoxO1在IR发生发展过程中的作用打下基础,同时为IR的治疗提供一定的理论依据。材料与方法1.采用高浓度胰岛素(10-6mol.L-1)诱导HepG-2细胞24h,建立IR细胞模型,并研究IR细胞模型持续时间。2.FoxO1特异性小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）载体的构建及测序鉴定。3.实验分组及处理。实验共分4组,A组:普通培养基孵育的HepG-2细胞组;B组:高胰岛素诱导建立的IR细胞组;C组:转染FoxO1 siRNA载体的IR细胞组;D组:转染试剂Lipofectamine2000为对照的IR细胞组。当细胞处于90%融合时进行转染,操作按照Lipofectamine2000说明书进行。4.荧光显微镜下观察转染情况。FoxO1 siRNA载体携带红色荧光标记,在转染后24h、48h、72h,分别于荧光显微镜下观查细胞内红色荧光的表达量,间接评估质粒载体转染入细胞的情况。5.转染后24h,计数细胞,调整细胞密度,各实验组均传代一次,在含有10-9mol.L-1胰岛素的培养液中孵育24h后,采用葡萄糖氧化酶法检测各组培养基中葡萄糖含量,以不铺细胞的空白孔为对照,计算24h葡萄糖消耗量。6.转染后48h,分别收集各组细胞,采用RT-PCR技术检测FoxO1mRNA的表达;采用Western blot,免疫沉淀技术检测IRS-2蛋白表达和IRS-2蛋白酪氨酸磷酸化水平。实验所得计量数值用平均数±标准差（（?）±s）表示。采用统计软件SPSS12.0行统计学分析,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。结果1.胰岛素抵抗HepG-2细胞模型的建立及持续时间HepG-2细胞加人新配制的含有10-6mol.L-1胰岛素的培养液,并设无胰岛素的空白组,于37℃,5%CO2培养箱中孵育24h,随后胃于含10-9mol.L-1胰岛素的培养基中24h,采用葡萄糖氧化酶法检测培养基中的葡萄糖含量,以不钠细胞的空白孔为对照。结果表明胰岛素组与空白组比较,葡萄糖消耗量减少约47.58%（1.76±0.07 vs 3.37±0.08）,胰岛素组细胞表现出明显的胰岛素抵抗。造模成功后,将模型组和空白组分别置于不含腆岛素的培养基中24、48、72h,重复上述方法计算葡萄糖消耗量,结果表明模型组细胞葡萄糖消耗量在48h内明显低于空白组（P＜0.01）,提示高浓度胰岛素诱导建立的胰岛素抵抗HepG-2细胞模型其IR特性在48h内较为稳定。2.重组质粒载体的测序将重组质粒载体用LB培养基扩大培养,提取质粒送往TaKaRa公司测序,测序结果显示同设计序列完全相同,载体构建成功。3.荧光显微镜下观察转染情况采用Lipofectamine2000为转染试剂,IR细胞转染携带红色荧光的FoxO1siRNA载体（pSIREN-DNR-DsRed-siFoxO1）,24h后倒置荧光显微镜下观察细胞内可见红色荧光表达,48h后荧光表达明显增强,72h时荧光表达减弱,认为转染后48h FoxO1 siRNA载体在细胞内成功且大量表达。4.葡萄糖氧化酶法检测各实验组细胞葡萄糖消耗IR细胞组与普通细胞组相比,葡萄糖消耗明显减少（1.90±0.07 vs 2.81±0.08,P＜0.01）;转染FoxO1特异性siRNA载体的IR组与未转染IR组比较,葡萄糖消耗增加（2.03±0.14 vs 1.90±0.07,P＜0.05）;Lipofectamine2000处理组与IR组相比,葡萄糖消耗差异不具有统计学意义（1.84±0.10 vs 1.90±0.07,P＞0.05）。5.RT-PCR技术检测各实验组FoxO1 mRNA的表达与普通细胞组相比,IR细胞组FoxO1 mRNA的表达增强（0.34±0.01vs0.31±0.01,P＜0.05）;IR细胞组在转染FoxO1特异性siRNA载体后,FoxO1 mRNA的表达水平明显下降（0.24±0.03vs 0.34±0.01,P＜0.01）;Lipofectamine2000处理组FoxO1 mRNA的表达与IR组相比,差异不具有统计学意义（0.33±0.03 vs0.34±0.01,P＞0.05）。6.IRS-2蛋白表达及其酪氨酸磷酸化水平的检测Western blot分析结果显示IRS-2蛋白表达各组之间无显著性差异（F=1.20,P＞0.05）。免疫沉淀结果显示:与普通细胞组相比,IR细胞组IRS-2酪氨酸磷酸化减低（Western blot灰度值（×103）为5.64±0.21 vs 6.92±0.14,P＜0.01）;转染FoxO1特异性siRNA载体后的IR细胞组与未转染IR组比较,IRS-2酪氨酸磷酸化增强（Western blot灰度值（×103）为6.66±0.17 vs 5.64±0.21,P＜0.01）;Lipofectamine2000处理组IRS-2酪氨酸磷酸化水平与IR组相比,差异不具有统计学意义（P＞0.05）。结论1.高浓度胰岛素诱导建立的胰岛素抵抗HepG-2细胞中,FoxO1 mRNA的表达增强,IRS-2酪氨酸磷酸化降低;高浓度胰岛素可能通过影响胰岛素信号的正常转导,引起胰岛素抵抗。2.抑制胰岛素抵抗HepG-2细胞中FoxO1异常表达,可通过反馈调节IRS-2活性（酪氨酸磷酸化）,改善胰岛素信号转导,提高胰岛素敏感性。

全文目录


摘要  3-7
Abstract  7-12
论文部分 FoxO1表达对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗的影响及机制研究  12-43
  前言  12-13
  材料与方法  13-27
  实验结果  27-29
  讨论  29-34
  结论  34-35
  附图  35-40
  参考文献  40-43
综述 转录因子FoxO1与肝脏胰岛素抵抗的分子机制  43-56
  参考文献  50-56
中英文缩略词对照表  56-58
致谢  58

相似论文

  1. 内皮素-1、胰岛素抵抗与急性缺血性脑血管病的相关性研究,R743.3
  2. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  3. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  4. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  5. 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆,S435.32
  6. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  7. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  8. HIF-1α在犬体外循环缺血再灌注心肌胰岛素抵抗中的表达及意义,R654.1
  9. 灰飞虱功能基因的克隆及其RNAi致死效应,S435.112.3
  10. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  11. 短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54干扰效应的研究,R346
  12. RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC-1细胞的影响,R735.9
  13. 三味药食同源中药对代谢综合征大鼠糖脂代谢及抗氧化的影响,R285.5
  14. 2型糖尿病个体中血清补体因子H，hs-CRP水平与胰岛素抵抗相关性研究,R587.1
  15. 脂质体介导的VEGF-C siRNA治疗肺癌体外实验研究,R734.2
  16. 蛇床子素改善脂肪肝大鼠的胰岛素抵抗及其作用机制研究,R285.5
  17. TAFI在多囊卵巢综合征患者中的表达及意义,R711.75
  18. 乳清蛋白改善胰岛素抵抗的机制研究,R587.1
  19. 靶向Bcl-xl的RNAi对胰腺癌细胞增殖凋亡及对吉西他滨化疗敏感性影响的实验研究,R735.9
  20. 飞蝗几丁质酶基因的功能研究,S433.2
  21. Sp1基因沉默对前列腺癌细胞CD59表达调控的作用研究,R737.25

中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
© 2012 www.xueweilunwen.com