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CDKL1 siRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响

作　者: 任黎
导　师: 许剑民
学　校: 复旦大学
专　业: 外科学
关键词: 周期素依赖性激酶 CDKL1 RNA干扰结直肠癌肝转移基因芯片
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

结直肠癌是常见的消化系统疾病,临床上主要采取以手术为主、化疗和放疗为辅的综合治疗,但其总体疗效仍不理想,术后5年生存率一直徘徊于50%-60%,其中肝转移是治疗失败的最主要原因。约15%-25%的患者在原发灶确诊时已伴有肝转移,原发灶根治术后的肝转移发生率仍高达15%-25%,因结直肠癌死亡的患者中约50%存在肝转移。尽管对结直肠癌肝转移已经进行了大量临床和基础研究,但是其机制仍未完全明确。因此,从分子生物学水平上探索结直肠癌肿瘤细胞增殖和侵袭能力以及对于转移机制的研究,会有利于结直肠癌肝转移的早期预测和诊断,从而提高结直肠癌术后5年生存率,具有重要意义。基因治疗(gene therapy)是将功能基因转移至患者体内,纠正有缺陷的基因或赋予患者功能,以达到临床治疗或预防疾病目的。通过转基因技术,也可使导入的DNA序列干扰癌基因表达、恢复抑癌基因功能及启动某种新的功能等。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术是由双链RNA启动序列特异的基因沉默,是生物体在进化中形成的一种内在基因表达调控机制。目前,RNAi技术已经广泛应用于基因功能鉴定,基因表达及转录后调控等热门研究领域,并为多种疾病的基因治疗提供新的思路。本课题组前期已应用基因芯片杂交技术筛选了结直肠癌肝转移患者与结直肠癌无肝转移患者中差异表达的基因,并用实时荧光定量PCR技术验证了具有显著差异表达的基因。基因芯片和实时荧光定量PCR验证结果均显示周期素依赖性激酶样1基因(cyclin-dependent kinase like 1, CDKL1)是其中最显著表达上调的基因之一,提示其可能与结直肠癌肝转移有关。本研究第一部分,设计了4个针对CDKL1基因的干扰片段,构建了RNAi-CDKL1慢病毒表达载体及pEGFP-N1-3FLAG-CDKL1真核过表达载体,将这两种质粒共转染293T细胞,筛选出可有效抑制CDKL1表达的干扰序列。荧光显微镜观察结果显示,所构建的慢病毒载体可高效转染293T细胞。Western blot结果显示,所设计的4段siRNA中,靶序列2(CTACTGTGATACCAAGAAA)对CDKL1基因表达具有显著的敲减和沉默作用,并进一步将此shRNA载体进行慢病毒的包装。第二部分,将包装好的慢病毒感染人结肠癌DLD-1和SW480细胞,qPCR和Western blot结果显示CDKL1敲减后,两种细胞中CDKL1的表达得到明显抑制。MTT法、克隆形成实验、流式细胞仪细胞周期检测和侵袭转移实验结果表明,上述结肠癌细胞的生长和增殖受到到明显抑制,克隆形成率明显降低,细胞周期中细胞阻滞在G1期,复制能力、增殖指数和侵袭能力明显降低,表明CDKL1具有影响结直肠癌细胞增殖、细胞周期和侵袭转移的功能。综上所述,本研究应用前期基因筛选的结果,利用RNAi技术构建siRNA-CDKL1慢病毒载体感染结肠癌细胞DLD-1和SW480,可显著抑制CDKL1 mRNA及蛋白的表达,上述细胞株内CDKL1受到敲减和沉默后,DLD-1和SW480细胞增殖受到明显抑制,克隆形成率明显下降,细胞周期阻滞于G1期,侵袭能力减弱。本研究结果提不CDKL1基因具有促使结直肠癌肿瘤细胞增殖和侵袭的功能,可作为结肠癌治疗的潜在作用靶点。

全文目录

缩略词  4-5
中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-14
  参考文献  11-14
第一部分 CDKL1 shRNA慢病毒载体构建、包装  14-50
  1. 前言  14
  2. 材料与方法  14-33
  3. 结果  33-44
  4. 讨论  44-48
  5. 参考文献  48-50
第二部分 RNAi介导CDKL1基因沉默对结直肠癌细胞DLD1和SW480生物学行为的影响  50-68
  1. 前言  50
  2. 材料与方法  50-54
  3. 结果  54-63
  4. 讨论  63-65
  5. 参考文献  65-68
总结与展望  68-69
综述  69-86
  参考文献  78-86
致谢  86-87
硕士期间发表的论文和专著  87-88

CDKL1 siRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响

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