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弓形虫ROP18-MIC2双基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

作　者: 陈琳
导　师: 何深一
学　校: 山东大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弓形虫 ROP18基因 MIC2基因核酸疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

弓形虫是一种专性细胞内寄生机会致病原虫,分布广泛,可感染包括人类在内的大部分哺乳动物。人类对弓形虫普遍易感,孕妇感染后可通过胎盘垂直传染给胎儿,导致畸胎、死胎。弓形虫病也是最常见的机会性寄生虫病,该病成为免疫功能严重低下患者(如HIV/AIDS、恶性肿瘤患者)的主要死亡原因。迄今尚无治疗弓形虫病的特效药物,弓形虫疫苗和免疫保护性研究已逐渐引起了重视,并认为疫苗接种可能是预防弓形虫病的最佳策略。大量的动物和人体实验表明,DNA疫苗不仅可以预防,还可以治疗病原生物的感染。在弓形虫感染和包囊形成的防治过程中,疫苗是一种潜在高效经济的方法。由于弓形虫生活史较复杂,抗原成分具有发育阶段的特异性或差异性,因此在研究有关弓形虫疫苗的过程中,发展多种抗原组合、针对不同生活史发育阶段的复合多价疫苗是研究弓形虫疫苗过程中的一个发展方向与共识,这有助于克服单一抗原成分作为候选疫苗的不足。棒状体蛋白在虫体入侵和纳虫空泡的形成和修饰过程中起着重要作用,是重要的入侵和毒力作用因子。棒状体蛋白18(rhoptry protein18, ROP18)可以改变受感染的宿主细胞的信号传导,阻止宿主细胞凋亡,改变感染细胞的基因表达,介导受感染细胞出现病理损伤。在最新研究中,科学家们发现当弓形虫进入宿主细胞时,会生成一层保护膜包裹自身,使自己虽受细胞环境影响而不被杀死,ROP18的作用则是让宿主细胞某些蛋白失效而无法破坏这层保护膜。微线体蛋白2(microneme protein2, MIC2)属于血小管反应蛋白相关匿名蛋白家族,是虫体入侵宿主细胞过程中一个必需的入侵因子,并在弓形虫连接到宿主细胞的过程中发挥重要作用。然而,至今还未有研究对ROP18、MIC2作为抗弓形虫病疫苗的潜力进行评估和检测。本文利用一新型真核表达载体pBudCE4.1,此含有人巨细胞病毒(CMV)高效启动子、增强子序列,是一种外源基因在哺乳动物内高效表达的良好载体。该载体的特点是含有两侧分别有一些可插入的酶切位点,而且两侧分别都有各自的启动子。将ROP18与MIC2构建在此载体上,并作为DNA疫苗直接注射免疫小鼠来表达两种蛋白,以检测蛋白在小鼠体内诱导的免疫原性和安全性,并通过动物攻击实验,评价其免疫保护性。结果表明ROP18-MIC2双基因疫苗的效果显著优于ROP18或者MIC2单基因疫苗。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号说明  10-12
前言  12-14
第一部分弓形虫ROP18、MIC2单价基因疫苗及ROP18-MIC2复合基因疫苗的构建  14-44
  材料与方法  14-32
    一、材料  14-15
    二、实验方法  15-32
  结果  32-43
    —、重组表达质粒pBudCE4.1-ROP18旳构建及鉴定  32-33
    二、重组表达质粒pBudCE4.1-MIC2旳构建及鉴定  33-34
    三、重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2  34-43
  讨论  43-44
第二部分弓形虫真核表达质粒ROP18-MIC2在哺乳动物HFF细胞的表达  44-56
  材料与方法  44-50
    一、材料  44
    二、实验方法  44-50
  结果  50-54
    —、RT-PCR结果  50
    二、SDS-PAGE电泳结果  50-54
  讨论  54-56
第三部分 ROP18、MIC2单基因及ROP18-MIC2复合基因疫苗对小鼠的免疫效果  56-67
  材料与方法  56-61
    一、材料  56
    二、实验方法  56-61
  结果  61-65
    一.抗体应答ELISA结果  61-62
    二.细胞因子测定  62-65
  讨论  65-67
参考文献  67-70
附图  70-73
致谢  73-74
攻读学位期间发表的学术论文目录  74-75
学位论文评阅及答辩情况表  75

弓形虫ROP18-MIC2双基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

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