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表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对耻垢分枝杆菌的抑菌作用

作　者: 刘宗楠
导　师: 辛毅
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 绿茶粗提物 EGCG 耻垢分枝杆菌抑菌作用聚阿拉伯半乳糖
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.TB）属于分枝杆菌属，是结核病的病原菌。其细胞壁厚而硬，并且具有疏水性，能够有效地保护细菌，因此抗菌药物的研发具有很高的难度。细胞壁是结核分枝杆菌赖以生存的结构基础，其核心结构为mAGP(Mycolic acid-Arabinogalactan-Peptidoglycan)，主要由分枝菌酸(Mycolicacid)、聚阿拉伯半乳糖(Arabinogalactan，AG)以及肽聚糖(Peptidoglycan)三部分共价连接组成。其中聚阿拉伯半乳糖是连接肽聚糖和分枝菌酸、维持分枝杆菌细胞壁结构完整性的重要组分，在细胞壁中含量较高，因此目前人们将聚阿拉伯半乳糖作为研发新一代抗结核药物的理想靶标。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate, EGCG）是从绿茶中分离得到的儿茶素类单体物质，是茶多酚生物活性的最主要成份。它具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变、抗衰老和抑菌等多种生物功能，是近年来国内外研究的热点之一。EGCG对具有特殊细胞壁结构、普通药物很难到达作用靶点的结核分枝杆菌作用如何，至今国内外未见报道。本研究采用与结核分枝杆菌具有相似遗传学特性、生长快速、但无传染性的耻垢分枝杆菌（M.smegmatis mc2155）作为模式菌来研究EGCG的抑菌机制。目的：1.从普通绿茶中提取绿茶粗提物；2.研究绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的抑菌作用；3.研究EGCG对耻垢分枝杆菌的抑菌作用；4.通过研究绿茶粗提物及EGCG对耻垢分枝杆菌细胞壁聚阿拉伯半乳糖(Arabinogalactan，AG)代谢的影响，进一步探讨EGCG对耻垢分枝杆菌的抑菌机制。方法：1.采用乙酸乙酯在中性条件下萃取绿茶，得到含有EGCG的粗提物；高效液相色谱法(HPLC)检测绿茶粗提物中的EGCG含量。2.利用纸片琼脂扩散法研究不同浓度绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的抑菌效果；利用酶标仪测定绿茶粗提物的最低抑菌浓度(MIC值)。3.利用抑菌圈实验研究EGCG对耻垢分枝杆菌的抑制作用；应用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy，TEM)观察其对耻垢分枝杆菌细胞壁结构及形态的影响。4.提取耻垢分枝杆菌细胞壁聚阿拉伯糖半乳糖(AG)；并通过薄板层析法来测定经EGCG及绿茶粗提物作用后的耻垢分枝杆菌细胞壁中聚阿拉伯半乳糖含量的变化，研究EGCG对耻垢分枝杆菌细胞壁AG代谢的影响。结果：1. HPLC结果显示成功提取了富含EGCG的绿茶粗提物。2.纸片琼脂扩散法证明了绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌具有明显的抑制作用，应用酶标仪测定了其最小抑菌浓度。3.抑菌圈实验证明了EGCG对耻垢分枝杆菌具有明显的抑制作用，透射电镜观察发现经EGCG处理后菌体细胞壁会发生扭曲变形等现象。4.薄板层析法证实绿茶粗提物处理后耻垢分枝杆菌细胞壁AG代谢会产生明显变化。结论：(1) EGCG能明显抑制耻垢分枝杆菌的生长；(2) EGCG能影响菌体细胞壁结构及形态的稳定；(3)绿茶粗提物能影响分枝杆菌细胞壁中聚阿拉伯半乳糖的代谢。推测EGCG很可能是通过影响耻垢分枝杆菌细胞壁AG代谢，破坏细胞壁结构的完整性，发挥其抑菌效应。未来研究方向:(1)深度研究EGCG对耻垢分枝杆菌细胞壁AG代谢的影响，用HPLC对AG进行定量分析，观察阿拉伯糖与半乳糖的比值变化。(2)体外培养人单核巨噬细胞THP-1，用结核杆菌感染THP-1细胞，再加入EGCG，显微镜下观察细胞形态变化，MTT法检测细胞存活率，碘化丙啶(PI)染色，BD流式细胞仪检测前凋亡峰所占比例，判断EGCG是否是通过提升宿主巨噬细胞的凋亡率来发挥其抑菌作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-12
材料与方法  12-16
结果  16-21
讨论  21-23
结论  23-24
未来工作  24-25
参考文献  25-27
综述  27-34
  参考文献  32-34
致谢  34-35

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对耻垢分枝杆菌的抑菌作用

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