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耻垢分枝杆菌MSMEG6402基因功能的研究

作　者: 何廉旗
导　师: 辛毅
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 耻垢分枝杆菌 双向电泳 高效液相色谱
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.TB）是引起结核病的病原菌。临床一线抗结核药物乙胺丁醇作用于细菌可以有效抑制繁殖期M.TB生长。实验表明,细胞壁是M.TB赖以生存的重要屏障,阿拉伯糖是细胞壁的重要组成成分。当乙胺丁醇作用于M.TB后,M.TB的细胞壁中阿拉伯糖大量流失,细胞壁结构遭到破坏。实验证明,乙胺丁醇是通过干扰阿拉伯糖基的活性供体聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖（Decaprenyl-phospho-arabinose, DPA）的代谢抑制M.TB的生长。实验证明,DPA的合成途径是由三个连续的反应组成:（1）5-磷酸核糖焦磷酸（5-phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP）在磷酸核糖转移酶（Rv3806c）作用下使聚十异戊二烯磷酸（ten isoprene poly phosphate, DP）脱掉焦磷酸基团生成5-磷酸聚十异戊二烯磷酸核糖（5-ten isoprene ribose phosphate polymer, 5-P-DPR）,（2）5-P-DPR在磷酸酶的催化作用下脱掉磷酸基团生成聚十异戊二烯磷酸核糖（ten ribose poly isoprene, DPR）,（3）DPR在差向异构酶（Rv3790、Rv3791）作用下生成DPA。在整个途径中,催化第二步反应的酶仍未测定。Rv3807c与Rv3806c处于同一启动子上,预测具有磷酸酶活性,可能是催化这个反应的酶。本课题使用M.TB的模式菌株耻垢分枝杆菌mc2155菌株（Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis）作为研究对象,（1）高效表达Rv3807c的同源基因MSMEG6402的可溶性蛋白,为进一步的功能测定奠定物质基础,（2）通过细胞壁组成分析,探索MSMEG6402基因在细胞壁阿拉伯糖的合成代谢途径中充当的角色,（3）采用蛋白质组学方法,寻找与MSMEG6402相关的基因,为推测MSMEG6402基因的功能提供更多的依据。实验方法:1.扩增MSMEG6402基因:从NCBI基因组数据库中获取MSMEG6402基因的核苷酸序列。根据核苷酸序列设计PCR引物,并在基因上、下游引物中引入BamHI和NdeI限制性内切酶位点。使用Ex Taq DNA聚合酶从M.S基因组中扩增MSMEG6402,PCR扩增的产物两端分别携带了BamHI和NdeI位点。2.克隆MSMEG6402基因:将扩增的MSMEG6402基因与pMD18-T载体的EcoRV位点连接,再将连接产物转化到大肠杆菌Novablue菌株的感受态细胞中。利用限制性内切酶方法筛选出阳性重组质粒,并对产物中的MSMEG6402片段进行DNA测序。测序结果与M.smegmatis基因组数据库中的MSMEG6402序列,检验在MSMEG6402基因扩增过程是否发生碱基突变。3.构建MSMEG6402基因的表达质粒:用T4 DNA连接酶将被测序正确的MSMEG6402连接到用于大肠杆菌的表达载体pET16b上,并将连接产物转化到大肠杆菌Novablue菌株的感受态细胞中。4.过表达MSMEG6402基因的蛋白:将表达质粒pET16-MSMEG6402转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。在37℃下使用0.6mM的IPTG诱导pET16-MSMEG6402表达,收获上清。5.检测过表达MSMEG6402基因的蛋白:通过SDS-PAGE电泳和Western Blotting检测可溶蛋白中是否有过表达的目的蛋白。6.分别提取野生型M.smegmatis菌株和MSMEG6402基因被敲除后的M.smegmatis（ΔMSMEG6402）菌株的细胞壁多糖,并将其水解成单糖。7.采用高效液相色谱法测定细胞壁中阿拉伯糖含量与半乳糖含量比值,并分析敲除MSMEG6402前后比值的变化。8.利用双向电泳技术分别检测野生型M.smegmatis和ΔMSMEG6402菌株中可溶性蛋白,并使用PDQuest 8.0软件分析两者之间的差异蛋白。实验结果:1.本实验成功表达可溶的MSMEG6402蛋白。2.ΔMSMEG6402菌株细胞壁中阿拉伯糖的含量明显低于野生型M.smegmatis细胞壁中阿拉伯糖的含量。3.应用双向电泳分离野生型M.smegmatis和ΔMSMEG6402菌株中可溶性蛋白,结果显示,野生型M.smegmatis约181个蛋白点,ΔMSMEG6402菌株中约198个蛋白点。4.利用PDQquest 8.0软件完成差异分析,野生型M.smegmatis和ΔMSMEG6402菌株中共存在5个差异蛋白点。结论:MSMEG6402基因在M.smegmatis细胞壁阿拉伯糖的合成代谢中发挥着重要作用,可能是参与了DPA的合成。未来研究方向:（1）纯化MSMEG6402,并测定其蛋白质功能,（2）体外模拟DPA合成通路,直接鉴定MSMEG6402是否是DPA合成途径的关键酶,（3）通过制备MSMEG6402基因表达蛋白的抗体,从不同方向研究MSMEG6402基因表达的变化。（4）对MSMEG6402基因敲除前后发生表达变化的蛋白进行分析,完善MSMEG6402在代谢网络中扮演角色的阐述。

全文目录


摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-13
材料与方法  13-22
结果  22-29
讨论  29-32
结论  32-33
参考文献  33-35
综述  35-42
  参考文献  40-42
致谢  42

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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