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甘草HMGR、SQS1和β-AS基因CNVs体系的构建

作　者: 席培宇
导　师: 刘春生
学　校: 北京中医药大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 乌拉尔甘草 HMGR SQS1 β-AS CNVs 遗传转化
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 34次
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内容摘要

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是常用的大宗药材之一,具有清热解毒、补脾益气、缓急止痛、祛痰止咳、调和诸药等功效,也是食品矫味剂、烟草添加剂的重要原料,需求量很大。目前野生甘草资源日趋匮乏,栽培甘草已经成为主流商品,但栽培甘草药材中普遍存在甘草酸含量低且不稳定等问题,严重地影响了甘草的临床疗效和质量控制。因此,提高栽培甘草中甘草酸的含量已经成为制约甘草资源可持续发展的关键性问题。由道地药材的形成机制可知,药材的质量主要受到功能基因和生态环境等因素的影响,其中遗传多样性是导致药材质量差异的分子生物学基础。基因拷贝数变异(CNVs)是近年来在人类基因组中发现的另外一类丰富的多态性来源,并且在人及哺乳动物中已得到广泛的研究,但其在天然植物类群中的研究及应用还未见到报道。从前人很多转基因过表达的研究中我们发现,相同的功能基因导入同一种植株中,基因在每个植株中都有表达,但是不同个体间的表达量存在明显的差异。由此推测可能是基因的剂量导致的,即在遗传转化过程中,基因发生了不同拷贝数的插入。因此,功能基因CNVs可能与产物的产量相关,基因拷贝数变异(CNVs)也许能进一步揭示甘草酸含量差异的分子机制。目前,主要是利用工程菌外源基因表达和转基因技术来实现植物功能基因拷贝数的变异。在工程菌外源基因表达技术方面,本实验已构建了甘草HMGR、SQS1和β-AS基因的毕赤酵母工程菌并测定了拷贝数,为甘草拷贝数变异与甘草酸含量差异的相关性研究奠定了基础。在转基因技术方面,以植物作为生物技术的实验材料有其特定的优点,它既可以作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器,以进行大规模生产,又可以用来研究基因在植物个体中的发育及其在正常生理代谢过程中的功能。因此,本实验以植物细胞系为表达系统,利用根癌农杆菌介导法,创造植物次生代谢产物生物合成途经中关键酶基因的拷贝数变异体系,进而阐明生物合成途径中功能基因发生拷贝数变异对产物形成的影响,为研究植物次生代谢产物含量差异的作用机制奠定基础。本论文的主要结果如下：(1)构建了含有甘草HMGR、SQS1和p-AS基因的植物表达载体,并成功转入到根癌农杆菌EHA105中。(2)建立了甘草组培快速繁殖体系。(3)通过根癌农杆菌介导法,将含有甘草HMGR、SQS1和p-AS基因的工程菌转入到甘草下胚轴及子叶节,并由下胚轴诱导了愈伤组织,由子叶节诱导生根成苗。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-8
英文略缩语  8-9
前言  9-10
第一章文献综述及本论文研究思路  10-22
  1 文献综述  10-20
    1.1 甘草酸生物合成途径的研究进展  10-12
    1.2 拷贝数变异(CNVs)的研究现状  12-13
    1.3 外源基因表达系统的研究现状  13-15
    1.4 植物遗传转化方法的研究进展  15-18
    1.5 甘草组织培养的研究进展  18-20
  2 研究思路与方法  20-22
    2.1 研究目标  20
    2.2 研究内容  20
    2.3 研究方案  20-22
第二章甘草HMGR、SQS1和B-AS基因表达载体的构建  22-40
  2.1 实验材料、试剂及仪器  22
  2.2 溶液及培养基配制  22-23
  2.3 实验方法  23-31
    2.3.1 带酶切位点的基因片段的获得  23-27
    2.3.2 表达载体的构建  27-31
  2.4 实验结果  31-39
    2.4.1 带酶切位点的基因片段的获得  31-35
    2.4.2 空表达载体的双酶切结果  35-36
    2.4.3 基因片段和空表达载体的连接结果  36-39
  2.5 小结  39-40
第三章含甘草HMGR、SQS1和B-AS基因的工程菌构建  40-47
  3.1 实验材料、试剂及仪器  40
  3.2 溶液及培养基配制  40-41
  3.3 实验方法  41-42
    3.3.1 重组质粒的提取  41
    3.3.2 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备  41
    3.3.3 重组质粒转化农杆菌  41-42
    3.3.4 阳性克隆的筛选及测序  42
    3.3.5 测序结果分析  42
  3.4 实验结果  42-46
    3.4.1 重组质粒的提取结果  42-43
    3.4.2 单克隆快速PCR鉴定  43
    3.4.3 测序结果  43-46
  3.5 小结  46-47
第四章植物外植体的遗传转化  47-56
  4.1 实验材料、试剂及仪器  47
  4.2 溶液及培养基配置  47-51
  4.3 实验方法  51-53
    4.3.1 植物外植体的遗传转化  51-52
    4.3.2 外植体的除菌、筛选及培养  52-53
  4.4 实验结果  53-55
    4.4.1 外植体的获得  53
    4.4.2 甘草下胚轴的筛选培养  53-54
    4.4.3 甘草子叶节的筛选及生根培养  54-55
  4.5 小结  55-56
第五章总结和讨论  56-58
  5.1 总结  56
  5.2 讨论  56-58
第六章展望  58-59
参考文献  59-63
致谢  63-64
个人简历  64

甘草HMGR、SQS1和β-AS基因CNVs体系的构建

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