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淡色库蚊arrestin基因克隆及其在抗药性中作用的初步研究

作　者: 邹萍
导　师: 朱昌亮
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 淡色库蚊抗药性 arrestin 基因克隆定量PCR 转染 siRNA 细胞存活率
分类号: R184
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要

淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是我国重要的家栖性传病媒介，严重危害人类健康。化学防制是控制蚊媒的有效手段。随着杀虫剂的长期大量使用，蚊媒对杀虫剂的抗性随之发生发展。鉴定新的抗药性基因并研究其如何参与抗药性机制，已成为媒介抗药性领域新的研究热点。本实验室前期研究发现并证明，视蛋白基因(opsin)为蚊抗药性相关基因。在进一步研究其抗性机制中发现，arrestin可能也参与蚊对溴氰菊酯抗性，另有文献报道，在致倦库蚊抗氯菊酯品系和果蝇抗DDT品系中，其arrestin较敏感品系高表达。在此基础上，本课题通过PCR方法，从淡色库蚊抗性品系中扩增arrestin基因的ORF序列，并采用RACE法扩增其5’和3’末端，对位拼接获取全长序列；通过实时荧光定量PCR分析arrestin在淡色库蚊敏感品系和抗性品系各发育阶段中的表达；随后，在蚊细胞水平先后通过转染高表达和RNAi低表达的方法，用CCK8方法检测arrestin对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响，同时通过过荧光实时定量PCR检测蚊抗药性基因CYP6A1和opsin的表达水平。本研究获得了淡色库蚊arrestin基因的全长cDNA序列，编码384个氨基酸（GenBank ID: HQ833831,2011）。其推导的氨基酸序列与致倦库蚊、冈比亚按蚊、黑腹果蝇的arrestin同源性分别为99％、92％、71％。荧光定量PCR结果显示，arrestin基因在淡色库蚊抗性和敏感品系的不同发育阶段均有表达，其中在卵、蛹和成虫阶段，抗性品系中较敏感品系高表达（p<0.05）。蚊细胞高表达arrestin后，细胞对溴氰菊酯的敏感性降低，CYP6A1和opsin的表达增高；蚊细胞低表达arrestin（siRNA介导的arrestin基因沉默）后，细胞对溴氰菊酯的敏感性增加，CYP6A1和opsin的表达降低。以上结果表明，arrestin为一新的蚊抗药性基因， arrestin可能通过与视蛋白一起作用，改变与拟除虫菊酯抗性相关的细胞色素P450的表达，参与蚊对溴氰菊酯的抗性。本研究首次报告蚊arrestin为一新的抗药性基因，并初步探讨了arrestin参与抗药性的机制。本研究结果为进一步阐明抗药性的分子机制，建立抗药性的检测方法和治理抗药性提供了新的科学依据，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-13
材料与方法  13-37
  一、材料  13-15
    （一）供试蚊  13
    （二）细胞株  13
    （三）主要试剂  13-14
    （四）主要仪器设备  14-15
  二、方法  15-37
    （一）淡色库蚊 arrestin 基因全长克隆  15-22
    （二）生物信息学分析  22
    （三）实时荧光定量 PCR 分析 arrestin 在蚊抗性、敏感品系不同发育阶段的表达  22-24
    （四）高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  24-33
    （五）抗性蚊细胞 arrestin 低表达对蚊溴氰菊酯敏感性的影响  33-36
    （六）统计分析  36-37
结果  37-51
  一、淡色库蚊 arrestin 基因克隆  37-39
    （一） arrestin 基因 ORF 序列扩增  37-38
    （二） arrestin 基因 5′端序列和 3′端序列的扩增  38-39
  二、生物信息学分析  39-42
    （一） arrestin 基因及其编码氨基酸的序列分析  39-40
    （二） arrestin 基因编码氨基酸同源性和分子进化分析  40-42
  三、实时荧光定量 PCR 分析 arrestin 在蚊抗性、敏感品系不同发育阶段的表达  42-43
  四、高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  43-48
    （一）昆虫表达载体构建及重组质粒的抽提  43-45
    （二）实时荧光定量 PCR 验证瞬转效率  45-46
    （三） Western blotting 鉴定 arrestin 的表达  46-47
    （四）高表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  47
    （五）实时定量 PCR 检测 CYP6A1 和 opsin 在各组细胞中的表达  47-48
  五、低表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  48-51
    （一）蚊细胞 arrestin 片段的克隆  48-49
    （二） siRNA 干涉效率验证  49
    （三）低表达 arrestin 对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  49-50
    （四）实时定量 PCR 检测 CYP6A1 和 opsin 在各组细胞中的表达  50-51
讨论  51-56
  一、淡色库蚊 arrestin 全长基因克隆分析  51-52
  二、淡色库蚊 arrestin 与抗药性的关系及其机制探讨  52-55
  三、实验中的相关技术讨论  55-56
小结  56-57
参考文献  57-65
综述  65-78
  参考文献  72-78
攻读学位期间发表文章情况  78-79
附录  79-81
致谢  81

淡色库蚊arrestin基因克隆及其在抗药性中作用的初步研究

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