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亚硫酸钠对肝细胞内甘油三酯含量和ARF-1、COP Ⅰ表达的影响

作　者: 赵春燕
导　师: 原福胜; 白剑英
学　校: 山西医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 亚硫酸钠 HepG2肝细胞 甘油三酯 腺苷酸核糖基化因子1 外被蛋白I 载脂蛋白E
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的前期的体内研究发现亚硫酸盐可引起肝细胞内出现明显的脂滴沉积，本次实验拟通过体外实验观察亚硫酸盐染毒后肝细胞内甘油三酯含量变化情况和极低密度脂蛋白（VLDL）分泌外排的关键蛋白分子改变情况，以探讨亚硫酸盐的肝损伤可能途径。方法将人肝癌细胞株（HepG2）培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，待细胞生长至对数生长期，用0. 25%胰蛋白酶溶液消化，将细胞调成一定密度的单细胞悬液，接种于培养板中。细胞融合至一定程度后，用不同浓度的亚硫酸钠（Na2SO3）对细胞进行染毒，其终浓度为0、0.039、0.156、0.625、2.5、10 mmol/L，并以四氯化碳（CCL4）染毒组作为Na2SO3的阳性对照,以完全培养基组作为阴性对照。采用乳酸脱氢酶（LDH）活力测定法检测肝细胞膜的通透性变化；采用CCK-8法检测肝细胞的活性改变；采用油红O染色法观察肝细胞内脂肪沉积情况，采用酶化学法检测肝细胞内甘油三酯（TG）含量；采用相应抗体进行蛋白印迹（western blot）分析分别检测ARF-1、COPI等蛋白表达水平；采用荧光定量PCR法检测ARF-1、COPI、APOE等基因的表达水平。结果1、LDH活性检测分析显示：染毒24 h后10 mmol/L Na2SO3可使肝细胞培养上清中LDH活性增加（p<0.05），释放率升高，与阴性对照组相比有显著性差异，其余各染毒组与对照组相比无显著性差异。染毒48 h和72 h后各染毒组培养上清中LDH的活性与对照组相比无显著性差异。2、CCK-8试验显示：处理24 h、48 h后各组HepG2细胞的存活率随Na2SO3剂量的增加而降低，与培养基对照组相比有显著性差异（p<0.05）；染毒72h后，除0.039 mmol/L组外，其他组细胞的存活率与培养基对照组相比均有显著性差异（p<0.05）。3、油红O染色法观察发现，染毒24 h 48 h后部分染毒组细胞内出现了极少量的脂滴，而阴性对照组却没有。染毒72 h后10 mmol/L的Na2SO3处理组出现明显脂滴。4、酶化学法检测肝细胞内TG试验显示：染毒24 h后，2.5 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L油酸可使肝细胞内TG含量明显增高，与对照组相比有明显差异（p<0.05）；染毒48 h后，10 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L油酸染毒组TG含量显著增高（p<0.05），分别为对照组的62.71倍和7.47倍；染毒72h后，2.5 mmol/L、10 mmol/L Na2SO3染毒组和1 mmol/L油酸组与对照组相比较差别有统计学意义（p<0.05）。5、Western blot实验显示Na2SO3染毒作用24 h后，ARF-1和COPΙ蛋白表达无明显变化；染毒作用48 h和72 h后肝细胞内ARF-1和COPΙ蛋白表达有随染毒剂量的增加而增加的趋势，其中2.5 mmol/L、10 mmol/L亚硫酸钠染毒组ARF-1和COPΙ蛋白表达明显增加。6、亚硫酸钠染毒作用24 h后，各剂量组HepG2细胞内ARF-1基因表达水平明显降低，0.039 mmol/L，2.5 mmol/L及10 mmol/L染毒组细胞内COPI基因表达水平，及0.156mmol/L和2.5 mmol/L Na2SO3组细胞内APOE基因的表达水平明显降低，与阴性对照组相比较，差别有统计学意义（P<0.05）；染毒作用48 h后，仅0.039 mmol/L亚硫酸钠作用组细胞内APOE基因表达水平低于对照组，有统计学意义（P<0.05）；染毒作用72 h后，0.039mmol/L亚硫酸钠作用组细胞内APOE基因表达水平仍低于阴性对照组（P<0.05）。结论1、Na2SO3对肝细胞活性有明显的抑制作用，且呈一定的剂量-反应关系。2、高浓度Na2SO3染毒可增加肝细胞膜的通透性，并且引起肝细胞内甘油三酯蓄积。3、Na2SO3染毒可增加肝细胞内ARF-1和COPI蛋白表达。4、Na2SO3对肝细胞ARF-1、COPI和APOE基因的表达水平有一定的抑制作用。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
中英文缩写词对照表  9-10
前言  10-11
材料与方法  11-18
  1.1 材料  11-12
  1.2 方法  12-18
  1.3 数据处理和统计学分析  18
结果  18-28
  2.1 Na_2SO_3染毒后 HepG2 细胞形态学变化结果  18-19
  2.2 Na_2SO_3染毒对 HepG2 细胞膜通透性的影响  19-20
  2.3 Na_2SO_3染毒对 HepG2 细胞活性的影响  20-21
  2.4 Na_2SO_3对 HepG2 细胞内甘油三酯含量的影响  21-23
  2.5 Na_2SO_3对 HepG2 细胞 ARF-1、COPI 蛋白表达的影响  23-24
  2.6 Na_2SO_3对 HepG2 细胞内 ARF-1、COPI、APOE 基因表达的影响  24-28
讨论  28-34
  3.1 Na_2SO_3对 HepG2 细胞膜通透性的影响  28-29
  3.2 Na_2SO_3对 HepG2 细胞活性的影响  29
  3.3 Na_2SO_3对 HepG2 细胞内 TG 的影响  29-30
  3.4 Na_2SO_3对 HepG2 细胞内 ARF-1、COPI 蛋白表达的影响  30-32
  3.5 Na_2SO_3对 HepG2 细胞内 ARF-1、COPI 和 APOE 基因表达的影响  32-34
结论  34-35
参考文献  35-40
综述  40-48
  参考文献  45-48
个人简历  48-49
致谢  49

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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