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人载脂蛋白AV的克隆、表达、纯化及蛋白分析

作　者: 王雁南
导　师: 王小宁
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 载脂蛋白 ApoAV 融合标签可溶表达圆二色谱
分类号: R543.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

甘油三酯水平升高作为冠状动脉硬化的独立致病因素,与冠心病、心肌梗塞和糖尿病等常见病都有密切联系。载脂蛋白AV(ApoAV)是和人血液中甘油三酯浓度息息相关的载脂蛋白A1/C3/A4/A5中的一员,它在人、狗、兔、鼠和禽类中都具有很高的保守性。ApoAV蛋白是唯一由肝脏分泌的蛋白,它虽然在体内含量非常低(约为ApoA1的千分之一),但却能显著降低血液中甘油三酯的量。ApoAV的作用机制可能是通过引导极低密度脂蛋白VLDL和乳糜微粒CM黏合到结合了蛋白聚糖的脂蛋白酶上,通过促进脂蛋白酶分解活性而降低血液内甘油三酯含量。因此对该蛋白的研究具有相当重要的现实意义。从动物体内直接提取的ApoAV蛋白非常微量并且难溶,不利于进行生化试验,因此目前对它的研究还都只是局限在基因层次上。本课题从含有人源ApoAV编码基因的质粒出发,利用载体pSJ5和ppSUMO构建两个融合表达质粒,分别转化入表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,经温度、诱导时间和诱导剂浓度等表达条件的优化实现了该蛋白的高效、可溶性表达。我们根据融合蛋白的特点和ApoAV的物理化学性质,经过两步镍柱和一步离子交换柱纯化获得了大量高纯度的ApoAV蛋白。圆二色谱(CD)分析证明该蛋白具有明显α-螺旋和β-折叠结构的,与二级结构预测的结果几乎完全吻合,表明制备的ApoAV折叠状态好,适合于进一步的生化实验、结构测定和功能研究。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-9
第一章绪论  9-20
  1.1 APOAV 的介绍及其研究进展  9-19
    1.1.1 ApoAV 的发现及其结构  9-13
    1.1.2 ApoAV 的功能和ApoAV 基因多态性  13-18
    1.1.3 ApoAV 的研究进展  18-19
  1.2 本论文研究的目的、主要内容和意义  19-20
第二章重组质粒PSJ5-APOAV 和PPSUMO-APOAV 的构建  20-35
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 培养基与抗生素  20
    2.1.2 菌种及载体  20-21
    2.1.3 试剂及试剂盒  21
    2.1.4 主要仪器设备  21-22
    2.1.5 主要试剂的配制  22
  2.2 实验方法  22-31
    2.2.1 实验基本方法  22-25
    2.2.2 目的基因制备  25-26
    2.2.3 pSJ5-ApoAV 和ppSUMO-ApoAV 表达质粒的构建和鉴定  26-31
  2.3 结果  31-33
    2.3.1 带酶切位点的 ApoAV 基因 PCR 扩增反应  31
    2.3.2 载体DNA 的限制性酶切  31-32
    2.3.3 重组质粒pSJ5-ApoAV 和ppSUMO-ApoAV 的鉴定  32-33
  2.4 讨论  33-34
    2.4.1 PCR 操作  33-34
    2.4.2 载体的选择  34
  2.5 本章小结  34-35
第三章 TRXA-APOAV 和 SUMO-APOAV 蛋白的表达  35-49
  3.1 材料  35-37
    3.1.1 培养基与抗生素  35
    3.1.2 质粒和宿主菌  35
    3.1.3 主要试剂  35-36
    3.1.4 主要仪器  36
    3.1.5 主要试剂配制  36-37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 基本实验方法  37
    3.2.2 Rosetta (DE3)作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达  37-39
    3.2.3 BL21(DE3)作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达  39-40
    3.2.4 BL21(DE3)作为宿主的SUMO-ApoAV 的表达  40-41
  3.3 结果  41-47
    3.3.1 Rosetta (DE3)作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达结果  41-44
    3.3.2 BL21(DE3)作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达结果  44-45
    3.3.3 BL21(DE3)作为宿主的SUMO-ApoAV 的表达结果  45-47
  3.4 讨论  47-48
    3.4.1 蛋白可溶表达策略  47-48
    3.4.2 破菌液的选择  48
  3.5 本章小结  48-49
第四章 APOAV 蛋白的纯化和表征  49-66
  4.1 材料  49-50
    4.1.1 菌体  49
    4.1.2 主要试剂  49-50
    4.1.3 主要仪器设备  50
    4.1.4 主要试剂的配制  50
  4.2 实验方法  50-54
    4.2.1 Rosetta(DE3)为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化  50-52
    4.2.2 BL21(DE3)为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化  52-53
    4.2.3 BL21(DE3)为宿主的SUMO-ApoAV 的纯化  53-54
    4.2.4 ApoAV 蛋白的圆二色谱分析  54
  4.3 结果  54-64
    4.3.1 Rosetta(DE3)为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化结果  54-59
    4.3.2 BL21(DE3)为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化结果  59-60
    4.3.3 BL21(DE3)为宿主的SUMO-ApoAV 的纯化结果  60-62
    4.3.4 ApoAV 蛋白的圆二色谱分析  62-64
  4.4 讨论  64-65
    4.4.1 蛋白纯化策略选择  64-65
    4.4.2 纯化过程中溶液的选择  65
  4.5 本章小结  65-66
结论与展望  66-68
  1. 结论  66-67
  2. 创新点  67
  3. 展望  67-68
参考文献  68-73
缩略词对照表  73-74
攻读硕士学位期间取得的研究成果  74-75
致谢  75-76
附件  76

人载脂蛋白AV的克隆、表达、纯化及蛋白分析

内容摘要

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