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ERS和UPR信号通路在PBDE-47神经毒性中的作用及其机制研究

作　者: 姜春阳
导　师: 王爱国
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: IRE1 UPR PBDE-47 神经毒性 SH-SY5Y细胞凋亡 siRNA
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

多溴联苯醚（polybrominated dipheny1ethers，PBDEs）是一类溴代阻燃剂型（brominated flame retardants，BFRs）化合物，被广泛作为一类重要的工业阻燃添加剂加入高分子合成材料中，作为防火材料广泛地应用于多种工业生产领域。由于没有化学键的束缚，PBDEs易从产品中迁移出来进入环境介质，导致环境污染。目前，世界上很多国家已经从空气、水、土壤、食物等多种环境介质以及人群的血液、乳汁、脂肪等组织中发现了PBDEs的存在。由于PBDEs是一类持久性有机污染物，其在环境介质中的含量呈现逐年增加的趋势。PBDEs的残留性和毒性很可能给环境和人体健康造成严重影响，其健康危害日益引起国际社会的广泛关注。近年来，大量体内外的实验研究结果证实，PBDEs可引起神经毒性、生殖毒性、肝肾毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PBDEs可通过胎盘转运和乳汁排泄、加上婴幼儿特有的手－口行为和频繁的地面接触及排泄PBDEs能力较成年人差等原因，致使婴幼儿体内PBDEs水平高于其它年龄段人群。婴幼儿期是大脑快速发育时期，因而在PBDEs导致的多种毒性作用中，神经系统的发育毒性尤其受到人们的关注。动物实验研究表明，在鼠大脑发育的关键期，暴露于于近似人体负荷量的PBDEs同系物，可损害实验动物脑部运动和认知区域，表现为自发行为异常，感觉运动障碍，学习记忆能力下降，并伴随染毒剂量增加或年龄增长而呈现恶化的趋势。PBDEs如何引起大脑形态和功能的异常是当前PBDEs神经毒性作用研究的热点之一，但PBDEs可通过哪些途径影响自主行为和学习记忆的机制目前仍不清楚。PBDEs可引起神经细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多，产生氧化应激反应。氧化应激是细胞凋亡级联反应中的始发因素，继而诱导神经细胞凋亡，产生神经毒性作用。有关PBDEs实验研究结果表明，PBDEs可以引起神经细胞由氧化应激介导的凋亡。神经细胞异常过度的凋亡，必将引起神经元结构和功能的改变，引发神经细胞的毒性作用。因此，细胞凋亡是PBDEs引起神经毒性作用的关键因素之一。内质网通路是细胞凋亡三条经典途径之一。内质网是细胞进行蛋白质的正确折叠、组装和运输的场所。当细胞受到体内外不同强度刺激，如氧化应激后，内质网将产生未折叠蛋白/错误折叠蛋白积聚，诱发内质网发生不同程度的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）,激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的信号通路。持续或过强的内质网应激，可引起内质网内环境的紊乱，从而通过UPR信号通路活化相关分子而介导细胞凋亡。目前尚未见内质网应激和UPR信号通路参与PBDEs致神经细胞凋亡的文献报道。但新近研究发现，PBDEs染毒大鼠海马神经元的内质网出现病理性改变；PBDEs的代谢产物可使染毒细胞UPR信号通路相关基因如葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）、生长抑制和DNA损伤诱导家族基因153（GADD153/C/EBP homologous protein，CHOP）、GADD34及X盒结合蛋白1（X-box-binding protein-1，XBP1）的表达发生改变。根据目前相关研究结果所提供的初步线索，推测PBDEs可能通过内质网应激和UPR信号通路导致神经细胞凋亡从而引起神经毒性。基于上述理由，本课题利用在环境样本和人体组织中含量最高、对生物和人体毒性作用最强的PBDEs同系物之一的2，2’，4，4’-四溴联苯醚（PBDE-47）作为目标受试物，将体外培养的具有神经细胞特性的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）作为受试细胞进行体外实验。采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（real time fluorescent quantitation reverse transcriptasepolymerase chain reaction，real time RT-PCR）、western blot和Hoechst33258细胞核染色等技术和方法，检测神经细胞ROS产生、细胞凋亡、神经细胞GRP78、内质网膜感应蛋白IRE1（inositol-requiring enzyme1）、XBP1、c-jun N末端激酶（c-junN-terminal kinase，JNK）和CHOP等基因mRNA和蛋白质的表达，并通过小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默IRE1后检测细胞凋亡、UPR通路相关分子的mRNA和蛋白表达的变化，探讨ERS与UPR细胞凋亡通路是否参与了PBDE-47致神经细胞的毒性效应，明确IRE1通路在PBDE-47产生的神经毒性中的作用。以期在PBDE-47致神经毒作用的分子机制研究方面获得新的进展，为PBDEs对机体危害作用的预防控制提供基础资料和理论依据，具有重要的理论和实际意义。第一部分PBDE-47对SH-SY5Y细胞产生氧化损伤并诱导UPR及激活IRE1信号通路目的：明确PBDE-47是否通过诱导SH-SY5Y细胞产生ERS和UPR而产生神经毒性作用，为研究PBDE-47的神经毒性作用机制提供线索。方法：SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的PBDE-47（0，1，5，10μmol/L），在不同时间点（3，6，12，24h），应用流式细胞术检测其ROS产生水平；应用real time RT-PCR技术和western blot技术分别检测细胞内GRP78、IRE1、CHOP、JNK、磷酸化JNK（phosphor-JNK，p-JNK）、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：与对照组相比，一定剂量的PBDE-47在3-24h内使SH-SY5Y细胞ROS产生明显增加（P <0.05）并具有一定的剂量-效应关系、GRP78和IRE1mRNA表达水平明显升高（P <0.05）并具有剂量-效应关系；用10μmol/L的PBDE-47处理SH-SY5Y细胞24h后IRE1和CHOP的蛋白表达水平均明显高于0，3，6和12h的表达水平（P <0.05）；不同浓度的PBDE-47处理SH-SY5Y细胞24h后，IRE1、CHOP和p-JNK蛋白表达水平较对照组明显升高（P <0.05），并具有浓度依赖性关系，Bcl-2蛋白表达水平较对照组明显下降（P <0.05），Bax/Bcl-2比值较对照组显著增加（p <0.01）。结论：PBDE-47可能通过增加细胞内ROS产生而引起细胞氧化应激，并导致ERS发生和激活UPR，通过内质网凋亡通路（氧化应激介导的ERS和UPR）对SH-SY5Y细胞产生神经毒性作用。UPR信号转导通路中的IRE1通路参与了PBDE-47所致的神经毒性作用。第二部分IRE1信号通路在PBDE-47致SH-SY5Y细胞毒性中的作用及其机制研究目的：由于IRE1是UPR中对细胞存活与死亡起决定意义的跨膜感应蛋白，IRE1具有重要的细胞凋亡调控作用，因此本研究旨在探讨IRE1细胞凋亡通路在PBDE-47致SH-SY5Y细胞神经毒性中的作用。方法：应用siRNA技术将SH-SY5Y细胞IRE1基因沉默后再暴露于10μmol/LPBDE-4724h，利用光镜和倒置荧光显微镜观察细胞形态以及经Hoechst核染色的细胞核形态；利用流式细胞术测定细胞凋亡，使用real time RT-PCR技术和western blot技术检测细胞内GRP78、IRE1、非剪切形式XBP1-XBP1u、剪切形式XBP1-XBP1s、CHOP、JNK、p-JNK、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：PBDE-47引起SH-SY5Y细胞体积收缩、呈现不规则形态变化，活细胞数量减少；核染色质呈现浓积、片断化、核破裂和细胞空泡样等改变，并可见凋亡小体。沉默IRE1基因后，PBDE-47引起细胞的凋亡性形态改变明显增加（P <0.05）。流式细胞术检测结果发现，PBDE-47可显著增加细胞凋亡率（P <0.05），沉默IRE1基因后PBDE-47引起的细胞凋亡率进一步增加（P <0.05）。与对照组相比，PBDE-47显著升高XBP1u、XBP1s、CHOP、JNK和Bax的mRNA表达水平（P <0.05或P <0.01），明显降低Bcl-2的mRNA表达水平（P <0.05）；与阴性对照+PBDE-47组相比，沉默IRE1基因后，用PBDE-47处理的细胞XBP1s、CHOP、JNK和Bcl-2mRNA表达水平显著下降（P <0.05或P <0.01），但Bax mRNA表达水平却显著升高（P <0.05），Bax/Bcl-2比值明显增加（P <0.05）。与阴性对照+PBDE-47组相比，沉默IRE1基因后，用PBDE-47处理的细胞CHOP、JNK和Bcl-2蛋白表达水平明显下调（P <0.05），但Bax蛋白水平显著上升（P <0.05），Bax/Bcl-2比值均明显增加（P <0.01）。结论：IRE1通过上调XBP1s、JNK和CHOP的表达激活相关细胞信号通路，从而对细胞具有抵抗内质网应激和促进细胞凋亡的双重作用；Bcl-2表达水平下调和Bax表达水平上升，Bax/Bcl-2比值显著升高是沉默IRE1后PBDE-47引起SH-SY5Y细胞凋亡增加的重要原因。在24h，IRE1对PBDE-47引起的SH-SY5Y细胞毒性作用以保护性作用为主导。

全文目录

英文缩写词汇表  6-8
摘要  8-13
Abstract  13-18
前言  18-21
第一部分 PBDE-47 对SH-SY5Y细胞产生氧化损伤并诱导UPR及激活IRE1 信号通路  21-45
  1 材料和方法  21-36
  2. 结果  36-42
  3 讨论  42-45
第二部分 IRE1 信号通路在PBDE-47 致SH-SY5Y细胞毒性中的作用及其机制研究  45-77
  1 材料和方法  45-62
  2 结果  62-72
  3 讨论  72-77
总结  77-80
参考文献  80-89
综述  89-109
  参考文献  99-109
博士研究生期间工作小结  109-111
致谢  111

ERS和UPR信号通路在PBDE-47神经毒性中的作用及其机制研究

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