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鸭坦布苏病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代致弱研究

作　者: 肖亚莉
导　师: 李国新
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 鸭坦布苏病毒 FX2010株致弱
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

自2010年4月以来，以引起蛋鸭产蛋下降为特征的鸭坦布苏病毒病的爆发，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。目前，该病已经在我国大部分养鸭地区流行。目前，尚无商品化的鸭坦布苏病毒病疫苗用来预防该病。在鸭坦布苏病毒病在我国发生的初期，本课题组就分离到了引起该病的病毒，鸭坦布苏病毒FX2010株。为了获得鸭坦布苏病毒的弱毒株并且寻找一些与病毒毒力致弱相关的关键位点，我们将鸭坦布苏病毒FX2010株在鸡胚成纤维细胞（CEF）上进行了连续传代培养。病毒传代培养至第3代以后即出现明显的细胞病变，而且随着传代次数增多，病毒接种后24-36小时就出现细胞病变。这些结果表明，连续传代培养使病毒逐渐适应了CEF细胞。鸭坦布苏病毒FX2010株在CEF上传173代后，用有限稀释法进行了5次纯化，然后继续在CEF上传代2次至第180代，获得了FX2010-180P株。FX2010-180P接种SPF鸡胚后，发现该毒株对鸡胚的致病力减弱了。为了探讨鸭坦布苏病毒奉贤分离株（FX2010）在CEF上的传代病毒FX2010-180P对鸭的致病力，依次进行了四次动物感染试验。（1）将FX2010和FX2010-180P分别经鼻腔接种21日龄雏鸭；（2）将FX2010和FX2010-180P分别经肌肉注射接种21日龄雏鸭；（3）将FX2010和FX2010-180P分别经肌肉注射接种180日龄产蛋鸭。在上述感染试验中，通过观察接种鸭的临床症状，病理变化以及病毒在鸭体内的分布情况，来确定病毒对鸭的致病力。（4）将FX2010和FX2010-180P分别经肌肉注射接种12周龄麻鸭，在接种后1-7天采集血清，用荧光定量PCR检测病毒RNA，以探究病毒感染引起的病毒血症情况。第一次雏鸭鼻腔感染试验显示，FX2010-180P经鼻腔感染鸭后，没有引起任何明显的临床症状，没发现任何脏器的病理变化，也未从鸭脏器中分离到病毒。由此，推测FX2010-180P经鼻腔感染鸭的能力降低了。因此，在第二次感染试验中，采用了肌肉注射方法进行接种。结果显示，FX2010-180P接种雏鸭在临床症状、病理变化等与正常对照鸭没有明显差别，但是在部分接种鸭的脾脏中分离到了病毒。上述这些结果表明FX2010-180P对雏鸭的致病力减弱了，而且经肌肉注射是有效的感染途径。为了探讨FX2010-180P对产蛋鸭的致病力，进行了第三次感染试验，结果显示，FX2010-180P经肌肉注射感染产蛋鸭后，结果与雏鸭肌肉注射感染一样，接种鸭没有任何不良反应，也只能在脾脏中分离到病毒。在第四次感染试验中，FX2010-180P感染后1-7天都没有检测到病毒血症。综上所述，与母源毒株FX2010相比，FX2010-180P具有以下几个主要特征：（1）对SPF鸡胚的致病力减弱了；（2）通过鼻腔感染易感鸭的能力降低了；（3）感染鸭没有表现任何明显的临床症状和病理变化；（4）感染鸭仅能在鸭脾脏中分离到低滴度的病毒；（5）感染鸭没有检测到病毒血症。总之，本研究经传代培养所获得的毒株FX2010-180P是一株安全性良好的弱毒株。黄病毒属病毒的宿主适应性和毒力的变化可能与其基因突变相关。为了探讨弱毒株FX2010-180P的基因变异情况，本研究对FX2010-180P病毒株进行了全基因组测序和序列分析。结果表明，与FX2010株相比，FX2010-180P全基因组共有34个核苷酸突变。在这些突变中，有20个核苷酸突变引起了19个氨基酸位点发生了突变，有12个核苷酸突变没有引起氨基酸变化，还有2个核苷酸突变位于3’非编码区（3’ NCR）。有研究表明，黄病毒属病毒的致病力不但受到氨基酸位点突变数目的影响，也和这些突变的特定组合相关。因此，本研究中，在结构蛋白或非结构蛋白上的这些氨基酸突变位点中的任何一个或者是它们中的某些特定的组合都可能是导致鸭坦布苏病毒毒力减弱的关键因素。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-17
第一章引言  17-24
  1.1 鸭坦布苏病毒概述  17
  1.2 鸭坦布苏病毒的形态结构  17-18
  1.3 鸭坦布苏病毒在细胞内的复制  18-19
  1.4 鸭坦布苏病毒的培养特性  19
  1.5 鸭坦布苏病毒的流行病学  19-20
  1.6 鸭坦布苏病毒的临床症状与病理特征  20
    1.6.1 临床症状  20
    1.6.2 病理特征  20
  1.7 鸭坦布苏病毒的诊断  20-22
    1.7.1 病毒分离鉴定  21
    1.7.2 血清学检测  21-22
    1.7.3 分子生物学诊断方法  22
  1.8 鸭坦布苏病毒的防控  22-23
  1.9 研究的目的及意义  23-24
第二章鸭坦布苏病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代培养  24-30
  摘要  24
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 病毒  24
    2.1.2 细胞  24
    2.1.3 主要仪器  24-25
  2.2 方法  25-26
    2.2.1 FX2010 在 CEF 上的传代培养  25
    2.2.2 病毒的克隆纯化  25-26
    2.2.3 传代毒毒价测定  26
    2.2.4 病毒对鸡胚的致病力测定  26
  2.3 实验结果  26-29
    2.3.1 FX2010 在 CEF 上的传代培养  26-28
    2.3.2 病毒克隆纯化结果  28
    2.3.3 传代毒毒价测定  28
    2.3.4 病毒对鸡胚的致病力试验的测定结果  28-29
  2.4 讨论  29-30
第三章鸭坦布苏病毒 FX2010-180P 毒对鸭的致病力  30-42
  摘要  30
  3.1 材料  30
    3.1.1 病毒和细胞  30
    3.1.2 试验动物  30
  3.2 方法  30-33
    3.2.1 雏鸭鼻腔感染病毒  30-31
    3.2.2 雏鸭肌肉注射感染病毒  31-32
    3.2.3 产蛋鸭肌肉注射感染病毒  32
    3.2.4 病毒感染雏鸭引起的病毒血症  32-33
    3.2.5 荧光定量 PCR  33
  3.3 结果  33-40
    3.3.1 鼻腔感染病毒对雏鸭的致病力  33-34
      3.3.1.1 临床表现  33
      3.3.1.2 剖检病变  33-34
      3.3.1.3 病理变化  34
      3.3.1.4 病毒分离  34
    3.3.2 肌肉注射病毒对雏鸭的致病力  34-36
      3.3.2.1 临床表现  34
      3.3.2.2 剖检病变  34-35
      3.3.2.3 病理变化  35
      3.3.2.4 病毒分离  35-36
    3.3.3 肌肉注射病毒对产蛋鸭的致病力  36-39
      3.3.3.1 临床表现  36
      3.3.3.2 剖检病变  36-37
      3.3.3.3 病理变化  37-39
      3.3.3.4 病毒分离  39
    3.3.4 病毒感染鸭引起的病毒血症  39-40
  3.4 讨论  40-42
    3.4.1 病毒对雏鸭致病力的评价指标  40
    3.4.2 剖检时间  40
    3.4.3 病毒对产蛋鸭致病力的评价指标  40-41
    3.4.4 传代病毒的致病力减弱  41
    3.4.5 关于感染途径  41-42
第四章鸭坦布苏病毒 FX2010-180P 基因序列测定及分析  42-51
  摘要  42
  4.1 材料  42-43
    4.1.1 病毒  42
    4.1.2 主要试剂和仪器  42
    4.1.3 引物设计与合成  42-43
  4.2 方法  43-46
    4.2.1 病毒 RNA 提取和 cDNA 合成  43-44
    4.2.2 病毒全基因的 PCR 扩增  44
    4.2.3 PCR 产物凝胶回收与纯化  44
    4.2.4 目的片段的连接转化  44-45
    4.2.5 阳性克隆的鉴定和序列测定  45
    4.2.6 FX2010-180P 株序列分析  45-46
  4.3 结果及分析  46-48
    4.3.1 基因变异氨基酸突变情况  46
    4.3.2 基因变异未导致氨基酸突变情况  46-48
    4.3.3 病毒遗传变异  48
  4.4 讨论  48-51
第五章全文结论  51-52
参考文献  52-56
致谢  56-57
作者简历  57

鸭坦布苏病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代致弱研究

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