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致弱日本血吸虫尾蚴诱导猪产生高保护力效应的免疫应答事件的研究

作　者: 田芳
导　师: 吴观陵
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 辐照致弱尾蚴疫苗 IFN-γ CTL 抗原表位
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

日本血吸虫病在我国主要分布在湖南、湖北、江西、安徽、江苏5省沿江及大湖周围以及四川、云南山区,目前仍然是主要的公共卫生问题之一。现有综合防治措施虽然有效,但效果难以巩固,因此发展血吸虫病疫苗,获取化疗“短效”作用与疫苗接种诱导较“长效”的免疫预防作用相结合的双重效益一直是血吸虫病防治研究追寻的目标。在血吸虫病候选疫苗的研究中发现辐照致弱尾蚴疫苗可以诱导多种动物获得对血吸虫感染的高保护性免疫力。目前辐照致弱尾蚴疫苗诱导高保护力的相关机制在曼氏血吸虫病中研究较多且较深入。在小鼠模型中的研究表明,抗体和CD4~+ T介导的,IFN-γ依赖的效应机制是其获得高保护力的重要原因。用中和抗体阻断IFN-γ作用后或在IFN-γ基因敲除(KO)及IFN-γ受体KO小鼠体内,辐照尾蚴疫苗免疫诱导的减虫率有不同程度的下降;而疫苗免疫小鼠后的血清被动转移到B细胞缺陷的小鼠体内可使其获得较高的保护力,且通过多次免疫可提高小鼠体内抗体水平,增强疫苗的保护效果。在灵长类动物(猩猩,狒狒)中的研究表明,在曼氏血吸虫辐照尾蚴疫苗多次免疫后可以诱导IFN-γ和IgG抗体水平的升高,在尾蚴攻击感染后,IFN-γ水平降低,而以Ⅱ型细胞因子的分泌为主,但IgG抗体一直维持在较高的水平,提示抗体水平与辐照尾蚴诱导灵长类产生高保护力相关。相应地,日本血吸虫辐照尾蚴疫苗在不同品系的小鼠体内所诱导的减虫率通常低于40%且不稳定,但在大动物如猪、牛的体内可获得较高的保护力。然而,辐照日本血吸虫尾蚴疫苗诱导保护力产生的免疫应答机制仍不明确,在大动物体内疫苗诱导的体液和细胞免疫应答仍未见系统、动态的详细研究报道。因此本研究拟对辐照日本血吸虫尾蚴诱导猪产生的保护力效应进行动态评估,包括检测疫苗免疫后,猪体内体液免疫和细胞免疫应答的动态改变,以及免疫相关基因转录水平的表达情况,为寻求适合的日本血吸虫病候选疫苗的研制策略进一步提供理论依据。虽然辐照致弱血吸虫尾蚴疫苗可以诱导大动物产生高水平的保护力,但对其介导产生高保护力的抗原仍知之甚少。辐照致弱尾蚴疫苗的动物模型是筛选保护性抗原的重要方法之一。鉴于Th1应答和抗体的产生对于辐照致弱尾蚴疫苗产生的高保护力可能起到关键作用,因此,本研究从辐照致弱尾蚴疫苗的猪模型中筛选一系列能够与高保护力的猪血清中IgG2型抗体(与Th1型应答相关)特异性结合,即“优势”诱导Th1型应答的抗原分子,并对其进行生物信息学分析和Th1、CTL和B细胞表位预测,希冀为组合有效的血吸虫病疫苗提供候选分子信息。本研究以二元长白猪为研究对象,观察UV辐照致弱日本血吸虫尾蚴疫苗免疫后对正常尾蚴攻击感染的保护力效应及相应的免疫学事件。通过测定不同实验组的猪感染后粪便排出的虫卵数、感染后8周猪体内灌注出的成虫数、肝脏沉积的虫卵数及相应的病理改变以评估疫苗诱导猪产生的保护力效果;为监测疫苗诱导宿主的整体免疫应答,用间接ELISA法检测不同时期猪血清中日本血吸虫特异性IgM、IgG、IgG1和IgG2抗体水平,同时检测不同时期猪外周血单个核细胞培养上清中Th1/Th2型细胞因子的表达水平;为了研究疫苗免疫后免疫应答相关基因的改变,以实时定量PCR技术比较了不同实验组在免疫和感染后早期皮肤引流淋巴结中相关基因转录水平的差异,及感染后8周采用Affymetrix公司的猪全基因组芯片,比较分析了不同组猪肠系膜淋巴结表达基因的转录水平差异。最后,利用免疫沉淀技术从具有高保护力的猪血清中筛选IgG2型抗体特异性识别的日本血吸虫成虫抗原,通过质谱技术和同源性比对鉴定所筛选的抗原分子,利用生物信息学技术预测其亚细胞定位及这些抗原的Th1、CTL和B细胞表位。本研究获得如下主要结果:1. UV致弱日本血吸虫尾蚴疫苗诱导二元长白猪产生了高水平的保护力。UV致弱尾蚴疫苗免疫后的猪(免疫攻击组)在正常日本血吸虫攻击感染的第8周体内的减虫率达到63.84%,肝脏减卵率达到71.82%,粪便排出的虫卵显著减少,肝脏炎症减轻,肝脏单卵肉芽肿数量减少,但单卵肉芽肿面积无显著差异。2.在体液免疫应答方面,免疫攻击组猪血清中IgM、IgG、IgG1和IgG2抗体水平在疫苗免疫后及攻击感染后早期显著升高,特别是IgG2抗体水平在攻击感染后8周(感染急性期),显著高于感染对照组。3.在细胞免疫应答方面,在疫苗免疫后和攻击感染后的早期,免疫攻击组猪外周血单个核细胞分泌的特异性IFN-γ水平较感染对照组显著升高,在感染后6-8周(感染后急性期)表现为Th1/Th2混合表型。4.疫苗免疫后早期,皮肤引流淋巴结中与CD4+ T细胞活化相关的基因ifnγ、il12p40、il4和il10,以及与CD8+ T细胞毒作用相关的基因granzyme b和nk-lysin mRNA水平高于正常尾蚴感染早期的表达水平。5.免疫攻击组猪在攻击感染后8周(感染急性期)肠系膜淋巴结中与细胞毒作用相关的基因(granzyme b、nk-lysin)转录水平显著高于感染对照组。采用高通量基因芯片技术分析比较不同实验组猪肠系膜淋巴结的基因转录水平,发现免疫攻击组比感染对照组基因信号增强1.5倍以上的有185个基因,其中主要是细胞毒作用相关基因(granzyme b、nk-lysin)、与T细胞活化相关的基因等。感染对照组与免疫攻击组相比,有207个基因信号增强1.5倍以上,主要为炎症相关基因、趋化因子及其受体的基因等。6.有5种日本血吸虫成虫抗原能与具有高保护力的猪血清(免疫攻击组)中IgG2型抗体特异性结合,运用计算机编制的预测软件预测这5种与保护力相关的抗原的细胞表位,CTL表位12个,Th1细胞表位11个,B细胞表位10个。本研究的科学意义在于1)系统、动态地描述了日本血吸虫辐照致弱尾蚴疫苗的猪模型中与高保护力诱导相对应的免疫学事件,整合和填补了以往报道的辐照致弱尾蚴疫苗在大动物宿主体内诱导的细胞免疫和体液免疫效应的零星和割裂的认知,特别是由于猪的生物学、免疫学和解剖学类似于人,故本研究报告的致弱尾蚴疫苗所诱导的免疫应答特征将有助于我们理解在人体可能诱导的免疫应答效应;2)复证并肯定了辐照致弱尾蚴疫苗在宿主体内诱导的以IFN-γ产生为主的细胞免疫和以IgG2抗体产生为主的体液免疫是诱导高保护力的关键效应,同时为CTL效应涉入提供了实验依据,提示我们在疫苗研制过程中,宜将针对特定的靶抗原,将诱导IFN-γ产生、IgG2抗体效应的分子及细胞毒作用分子进行有效组合,以获得更高的保护力;3)运用了免疫沉淀和质谱技术在日本血吸虫辐照尾蚴疫苗猪模型上初步筛选了与保护力相关的抗原分子,并预测了其抗原表位。为日本血吸虫病疫苗的研制提供新的候选疫苗表位,为未来设计和构建有效表位组合疫苗打下基础。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-79
  第一部分 UV 致弱日本血吸虫尾蚴诱导猪产生的保护力效应及其免疫应答事件的研究  13-54
    一、前言  13-16
    二、材料方法  16-41
    三、结果  41-49
    四、讨论  49-54
  第二部分与辐照日本血吸虫尾蚴诱导猪产生的高保护力相关的抗原及表位的初步筛选  54-79
    一、前言  54-56
    二、材料方法  56-63
    三、结果  63-73
    四、讨论  73-79
小结  79-81
参考文献  81-92
综述  92-102
  参考文献  98-102
附录  102-103
致谢  103-104

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