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山东省部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其与鸭圆环病毒共感染的检测

作　者: 李兆华
导　师: 刁有祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 鸭疫里默氏杆菌分离鉴定耐药性鸭圆环病毒混合感染
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病,该病又称为新鸭病、鸭疫综合征、传染性浆膜炎和鸭疫巴氏杆菌病等。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等,发病率高,病死率也高。耐过鸭多成僵鸭,生长迟缓,造成极大的经济损失,是目前危害养鸭业的主要传染病之一。药物治疗作为最主要的防治手段,却常常因为该菌极易产生耐药性而导致治疗失败,带来不必要的经济损失,因此开展对该菌的耐药性及耐药基因方面的研究尤为重要。(一)山东省部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定对2009年6月-2010年12月自山东省潍坊、泰安、临沂、烟台、青岛、济南等地区的部分鸭场无菌采集疑似鸭疫里默氏杆菌感染病死鸭的肝脏、心脏,等病料划线接种进行细菌的分离培养,取纯化培养的典型菌落进行菌落形态观察和染色镜检,同时挑取典型菌落按Edwards PR等(Edwards,1972)的方法进行生化试验,对分离菌株加以鉴定。根据已发表序列建立了种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物对分离菌株做进一步鉴定。结果分离到19株鸭疫里默氏杆菌。通过玻片凝集试验、琼脂扩散试验对分离菌株进行了血清型鉴定,分离得到的菌株中有4株为RA1型,15株为RA2型。对分离菌株在樱桃谷雏鸭进行了动物回归试验,发病鸭主要临床症状为缩颈,嗜眠,精神不振,共济失调,采食减少,排黄绿色粪便,眼流出粘液样分泌物,48h后出现死亡,120h后全部死亡。病死鸭剖检,可见心包炎,气囊炎,肝脏肿大,肝脏表面有一层薄膜状的纤维素性渗出物,脾脏肿大,出血。肝脏、心脏病理组织学变化与与临床表现一致。(二)鸭疫里默氏杆菌山东分离株耐药性检测与分析将试验一中分离菌株按纸片扩散法进行针对丁胺卡那、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、氨苄青霉素、青霉素、链霉素等9种药敏的药敏试验,结果表明：山东各地区鸭疫里默氏杆菌耐药情况均很严重,对卡那霉素、丁胺卡那、青霉素、新霉素有很强的耐受力,对红霉素敏感度最高,其次为氨苄青霉素和四环素。所有受试菌株对红霉素最为敏感,。整个山东地区的多重耐药现象极其严重,四耐、五耐菌株所占的比例最大,占总菌株数的63.16%。没有一株细菌是单纯耐受一种抗生素的。(三)鸭疫里默氏杆菌病鸭群中鸭圆环病毒的共感染从本研究鉴定为鸭疫里默氏杆菌阳性鸭的19份样品的脾脏及法氏囊等脏器中按常规方法提取总DNA,根据文献设计合成了一对用于DuCV扩增约228bp的特异性检测引物,对上述19份DNA样品进行了PCR扩增并对扩增产物进行了克隆和测序验证,结果在19份DNA样品有8份显示DuCV为阳性。病理学分析认为,DuCV感染侵害免疫组织表现为淋巴细胞萎缩、坏死等,从而增加了其它细菌或病毒感染的可能性。本研究也从一个侧面说明了DuCV的流行传播很可能是鸭疫里默氏杆菌等细菌病高发病率和致死率的诱因之一。

全文目录

符号说明  3-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
1 前言  10-36
  1.1 鸭疫里默氏杆菌研究进展  10-33
    1.1.1 鸭疫里默氏杆菌病流行历史  10-11
    1.1.2 病原  11-16
    1.1.3 流行病学  16-17
    1.1.4 临床症状  17-18
    1.1.5 病理变化  18
    1.1.6 免疫原性  18-19
    1.1.7 诊断  19-24
    1.1.8 防治  24-30
    1.1.9 细菌耐药性  30-33
  1.2 鸭圆环病毒研究进展  33-36
    1.2.1 鸭圆环病毒的发现  33-34
    1.2.2 鸭圆环病毒的危害  34
    1.2.3 鸭圆环病毒的基因组  34-35
    1.2.4 鸭圆环病毒的诊断  35-36
2 材料与方法  36-45
  2.1 材料  36-37
    2.1.1 病料采集  36
    2.1.2 主要试剂、培养基及仪器  36-37
    2.1.3 实验动物  37
  2.2 方法  37-45
    2.2.1 细菌的分离培养  37
    2.2.2 细菌的鉴定  37
    2.2.3 血清型的鉴定  37-38
    2.2.4 分子生物学鉴定  38-39
    2.2.5 动物回归试验  39
    2.2.6 细菌的培养、计数  39
    2.2.7 药敏试验  39-40
    2.2.8 组织DNA的提取  40
    2.2.9 DuCV引物的涉及与合成  40
    2.2.10 PCR反应条件  40-41
    2.2.11 电泳检测  41
    2.2.12 PCR产物的回收与定量  41-42
    2.2.13 DNA的连接反应  42
    2.2.14 TG1大肠杆菌感受态细胞的制备  42
    2.2.15 连接产物的转化  42-43
    2.2.16 质粒DNA的提取  43
    2.2.17 重组质粒DNA的酶切鉴定  43-44
    2.2.18 阳性克隆序列测定  44-45
3 结果与分析  45-52
  3.1 细菌的培养特性  45
  3.2 细菌的鉴定  45
    3.2.1 染色镜检  45
    3.2.2 生化试验  45
  3.3 血清学鉴定  45
  3.4 分子生物学鉴定  45-47
  3.5 动物回归试验  47
  3.6 细菌的培养与计数  47
  3.7 药敏试验结果  47-50
  3.8 DuCV检测结果  50
  3.9 DuCV的序列分析  50-51
  3.10 DuCV的阳性率及分析  51-52
4 讨论  52-55
5 结论  55-56
参考文献  56-65
致谢  65

山东省部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其与鸭圆环病毒共感染的检测

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