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酞酸酯类化合物的雌激素活性及生物降解的研究

作　者: 杨雪
导　师: 熊丽
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酞酸酯类化合物类雌激素活性重组基因酵母法小鼠子宫增重法半定量RT-PCR 生物降解分离鉴定
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

酞酸酯类化合物(phthalate esters)目前被广泛用于工业原料,因其在环境中易扩散、分布广、难降解以及具有潜在的雌激素活性而普遍受到人们的关注。本研究首先采用转入人雌激素受体α(ERα)基因以及雌激素受体共激活因子(Coactivator)的双杂交酵母测定了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)的类雌激素活性,并进行了比较。为进一步研究酞酸酯类化合物在体内的类雌激素活性及其产生的机制,选取在酵母双杂交实验中具有代表性的BBP,对17-18天的雌性昆明小鼠进行为期一周的腹腔注射来进行染毒。首先通过传统的子宫增重法来检测子宫的增重效应,同时通过HE染色切片法测量子宫内膜上皮细胞高度的变化,这两种方法分别从生理和病理的水平上检测了BBP在小鼠体内产生的雌激素效应。另外,还采用半定量反转录PCR (semi-quantitative RT-PCR)检测雌激素受体α(ERβ)和雌激素受体β(ERβ)基因的表达状况,并对三种方法的结果进行了比较分析。最后,为了分离出对酞酸酯类化合物降解效果较好且具有一定特性的菌株,从污染较严重的河流底泥中筛选出了两株降解邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)的菌株,也为进一步研究酞酸酯类化合物的生物降解特性和规律奠定了基础。结果显示,DEP(1×10-7-1×10-9mol/L)、DBP(1×10-6-1×10-9 mol/L)、BBP (1×10-3-1×10-6mol/L)具有明显的类雌激素活性,诱导的最大酶活分别为：1.515U、0.8322U、1.669U,而DMP和DOP并未检出明显的类雌激素活性。DEP、DBP、BBP与17β-雌二醇(E2)的EC50的比分别为8.85×10-2、2.54×10-2、8.82×10-6。说明DEP、DBP在低浓度就表现出类雌激素活性,而BBP在较高浓度才表现出类雌激素活性。小鼠实验的结果显示,随着BBP浓度的增加,子宫系数、子宫内膜上皮细胞高度以及ERa基因的相对表达量与对照相比都有显著性增加。子宫系数在2.5ml/kgBBP组达到最大水平；字宫内膜上皮细胞高度在1.25ml/kg·bw BBP组达到最大水平；而ERa基因相对表达量在0.25ml/kg·bw BBP组达到最大水平。三组实验的结果具有一致性,结果暗示了,BBP类雌激素活性是通过与ERa作用而产生的,半定量RT-PCR作为检测BBP类雌激素活性的标志物更敏感。另外,根据半定量RT-PCR的结果可以推测ERβ与ERa可能存在拮抗作用,ERp可能保护了因BBP与ERa的作用而导致的子宫增重及水肿作用。因此,对ERβ的研究在子宫癌、乳腺癌等癌症的治疗方面将具有一定的前景。从受污染严重的河水中筛出的两株BBP降解菌,分别命名为HS-B1、HS-B2。结合菌株形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列比对,分别鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)。24小时内,两株菌对500mg/LBBP的降解分别为28%、59%。研究发现加入0.1%的LB,24小时内能增加降解等浓度BBP的降解率分别至40%、75%,说明加入适当的碳源有利于菌株对BBP的降解。与国内外报道的BBP降解菌相比,本研究分离出的两株菌对高浓度BBP有一定的耐受性,并且降解率相对较高。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-21
  1.1 环境雌激素概述  10-14
    1.1.1 环境雌激素的概念  10
    1.1.2 环境雌激素的结构、性质及分类  10-11
    1.1.3 环境雌激素的作用机制  11-12
    1.1.4 环境雌激素对人体的危害  12-13
    1.1.5 环境雌激素的生物检测及筛选  13-14
  1.2 酞酸酯类化合物概述  14-16
    1.2.1 酞酸酯类化合物污染现状及危害  14-15
    1.2.2 酞酸酞类化合物雌激素活性的研究现状  15
    1.2.3 酞酸酯类污染物的净化  15-16
  1.3 雌激素受体在环境雌激素效应评估中的应用  16-17
    1.3.1 雌激素受体的分类以及蛋白结构  16-17
    1.3.2 雌激素受体应用于环境雌激素效应评估的研究进展  17
    1.3.3 雌激素受体检测方法的研究进展  17
  1.4 酞酸酯类化合物生物降解的研究进展  17-19
    1.4.1 酞酸酯类化合物的降解过程  18-19
    1.4.2 降解酞酸酯类化合物的细菌  19
  1.5 本研究的目的和意义  19-21
第二章酵母双杂交法对酞酸酯类化合物类雌激素作用的研究  21-26
  2.1 引言  21
  2.2 材料与方法  21-22
    2.2.1 材料  21
    2.2.2 实验方法  21-22
  2.3 结果与分析  22-25
  2.4 讨论  25-26
第三章 BBP在小鼠体内的类雌激素活性的研究  26-33
  3.1 引言  26
  3.2 材料与方法  26-27
    3.2.1 材料  26-27
    3.2.2 实验方法  27
  3.3 结果与分析  27-32
    3.3.1 脏器系数结果  27-30
    3.3.2 HE染色切片结果  30
    3.3.3 RT-PCR结果  30-32
  3.4 讨论  32-33
第四章 BBP降解菌的筛选、鉴定  33-40
  4.1 引言  33
  4.2 材料与方法  33-35
    4.2.1 材料  33-34
    4.2.2 菌株的富集、分离与纯化  34
    4.2.3 菌株的形态及生理生化特性测定  34
    4.2.4 菌株的16SrDNA的扩增及系统发育树的构建  34
    4.2.5 BBP降解率的测定  34-35
  4.3 结果与分析  35-39
    4.3.1 菌株的分离、形态特征及部分生理生化鉴定  35-36
    4.3.2 HS-B1、HS-B2菌株16Sr DNA的扩增、序列测定及系统发育树的构建  36-37
    4.3.3 HS-B1、HS-B2菌株对BBP的降解  37-39
  4.4 讨论  39-40
结论  40-41
参考文献  41-51
硕士期间发表论文  51-52
致谢  52

酞酸酯类化合物的雌激素活性及生物降解的研究

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