学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究

作　者: 陈安莉
导　师: 谢芝勋
学　校: 广西大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒分离鉴定全基因遗传进化分析 LAMP 鸭瘟病毒二重PCR
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 96次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

新城疫(Newcastle disease, ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒属的新城疫病毒引起的高度接触性传染病。水禽曾被认为是新城疫病毒的天然储存库,尤其是鸭,对ND有很强的抵抗力,一般鸭群中都潜伏有病毒,但不表现明显的临床症状。但自从1999年来不断有发生鸭源新城疫疾病的报道。2008-2010年从广西不同活禽市场鸭群中分离纯化了7株有血凝性的病毒,这7株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制,而不能被禽流感多种H亚型阳性血清抑制,经过HA、HI试验和RT-PCR检测结果,确定为新城疫病毒。7株病毒的鸡胚平均致死时间(MDT)93.6h-162h,鸡胚半数致死量(ELDso)为10-6.786/0.1mL-10-8.438/0.1mL,3株代表株的ICPI为0.15-0.30,推测该7株病毒为弱毒型NDV。为进一步探讨7株NDV鸭源NDV毒株GX16/2008、GX17/2009、GX18/2009、GX19/2009、GX20/2010、GX21/2010和GX22/2010的分子病原学特征,运用RT-PCR方法获取了它们的全基因组序列,并对其进行了比较分析。此7株病毒的全基因组序列均由15186个碱基组成,与GenBank公布的LaSota、B1、Clone30、Ireland Ulster67毒株的全基因组序列长度相同。F蛋白裂解位点的氨基酸序列表明所有的分离株都是无致病性的序列。7分离株中5株氨基酸顺序为112G-K-Q-G-R-L117,2株为112G-R-Q-G-R-L117,绘制的进化树分析表明其中5株属于NDVs基因I型,2株属于基因Ⅱ型。它们在全基因组核苷酸和氨基酸水平上,发现与HM125898WDK/JX株相似性较接近,而与F48E8、Mukteswar等毒株的同源性较低。根据NDV F基因的8个区域设计能区分强、弱毒株的3套特异性引物,并对反应温度、甜菜碱浓度及Mg2+浓度分别进行优化,建立了新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法。结果表明该方法可成功地区别不同基因型的NDV强弱毒株,而对常见鸡源病毒均无扩增反应,该方法且对NDV RNA的最小检测限为0.0lpg,灵敏度是RT-PCR方法的100倍,具有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上区分NDV强弱毒的快速检测。根据GenBank公布的NDV和DPV的基因序列,设计了针对NDV和DPV的保守基因序列的2对特异性引物,运用二重PCR方法对加入同一反应管中的NDV和DPV模板进行检测,结果得到了2条大小与实验设计相符的419bp(NDV)和602bp(DPV)的特异性扩增条带,而其它禽病病原未见任何扩增条带,敏感性试验结果表明,该二重PCR技术最低能同时检出0.4pg的NDV模板和126pg的DPV模板。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
前言  11-13
第一部分文献综述  13-20
  1.1 新城疫病毒的概况  13-15
    1.1.1 NDV的分子生物学特性  13-14
    1.1.2 NDV的理化特性和分类  14-15
  1.2 ND的流行情况  15-16
  1.3 NDV的毒力演化  16-17
  1.4 ND诊断方法的研究进展  17-19
    1.4.1 NDV的分离鉴定技术  17
    1.4.2 NDV的血清学诊断技术  17-18
    1.4.3 NDV的分子生物学诊断技术  18-19
  1.5 研究目的和意义  19-20
第二部分鸭源新城疫病毒分离鉴定、全基因序列测定及遗传进化分析  20-42
  试验一鸭源新城疫病毒的分离鉴定和部分生物学特性的研究  20-26
    1 材料和方法  20-23
      1.1 材料  20-21
      1.2 病料的采集  21
      1.3 病毒的分离  21
      1.4 血凝及血凝抑制试验  21
      1.5 病毒的纯化  21-22
      1.6 病毒的生物学特性的测定  22
      1.7 RT-PCR检测  22-23
    2 结果  23-24
      2.1 病毒的分离鉴定与纯化增殖  23
      2.2 鸡胚平均致死时间(MDT)和鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定结果  23
      2.3 1日龄雏鸡脑内接种致病指数测定(ICPI)结果  23
      2.4 RT-PCR扩增结果  23-24
    3 讨论  24-26
  试验二 7株鸭源NDV分离株全基因序列测定及遗传进化分析  26-42
    1 材料与方法  27-30
      1.1 毒株  27
      1.2 主要试剂  27
      1.3 引物设计及合成  27
      1.4 病毒RNA的提取与反转录  27-28
      1.5 PCR扩增  28
      1.6 PCR产物的初步鉴定  28-29
      1.7 目的片段的纯化与回收  29
      1.8 连接与转化  29
      1.9 阳性克隆质粒的鉴定  29-30
      1.10 克隆片段的序列测定  30
      1.11 测序结果的拼接和比较分析  30
    2 结果  30-31
      2.1 NDV分离株全基因组序列RT-PCR扩增结果  30
      2.2 F基因遗传进化分析  30-31
      2.3 全基因组同源性分析  31
      2.4 HN基因的遗传进化分析  31
      2.5 全基因组阅读框的比较  31
    3 讨论  31-42
第三部分鸭源NDV检测方法的研究  42-58
  试验一新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立  42-51
    1 材料与方法  42-45
      1.1 试验毒株  42-43
      1.2 试验主要试剂  43
      1.3 引物设计与合成  43-44
      1.4 病毒RNA的抽提与反转录  44-45
      1.5 LAMP方法的优化  45
      1.6 LAMP的特异性和敏感性试验  45
      1.7 重复性试验  45
    2 结果  45-49
      2.1 LAMP反应条件的优化  45-47
      2.2 特异性试验结果  47-48
      2.3 敏感性试验结果  48-49
      2.4 重复性试验结果  49
    3. 讨论  49-51
  试验二鸭源新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立  51-58
    1 材料和方法  51-54
      1.1 试验毒株  51-52
      1.2 对照菌(毒)株  52
      1.3 试剂  52
      1.4 病毒的增殖和收集  52
      1.5 菌(毒)株核酸的提取  52
      1.6 引物设计和合成  52-53
      1.7 二重PCR方法的反应体系  53
      1.8 不同引物浓度及退火温度的优化  53
      1.9 特异性试验  53
      1.10 敏感性试验  53-54
      1.11 临床样品的检测  54
    2 结果  54-56
      2.1 引物浓度及退火温度的优化结果  54-55
      2.2 二重PCR特异性试验结果  55
      2.3 二重PCR敏感性试验结果  55-56
      2.4 临床样品的检测  56
    3 讨论  56-58
结论  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
个人简历  67
攻读学位期间发表论文情况  67

鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究

内容摘要

全文目录

相似论文