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牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性研究

作　者: 王延群
导　师: 涂亚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛α干扰素 毕赤酵母 基因优化 高效分泌表达 抗病毒
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


我国是养牛大国，但由于多种传染病的影响，严重制约了养牛业的发展，如：奶牛乳腺炎、口蹄疫、牛病毒性腹泻等。研究表明，重组牛干扰素(boIFN-)在体外具有抗水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等多种病毒的作用。干扰素广泛的抗病毒和多种免疫调节功能，使干扰素对重大传染病具有一定的预防和控制作用。高效表达高活性的boIFN-将有利于疾病的预防和控制。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种成熟的真核表达工具，已成功高效分泌表达多种蛋白，本研究采用毕赤酵母高效分泌表达牛干扰素并进行活性分析研究，为牛干扰素的大规模应用奠定了基础，为牛常见疾病的预防和控制提供了实验依据。本研究首先对boIFN-基因进行优化，主要通过密码子偏嗜性优化，G+C含量调整，AT富含区调整等几个方面。将优化后的opti-boIFN-基因克隆于毕赤酵母专用分泌型表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-opti-boIFN-，电转毕赤酵母感受态GS115，通过MD板（营养缺陷型）和不同浓度的YPD-G418板筛选阳性克隆进行诱导表达，取诱导上清SDS-PAGE电泳、western blot分析。同时采用单因素实验方法，分别摸索最佳诱导条件，优化发酵条件：培养转速、培养温度、甲醇诱导浓度、诱导时间和转接浓度。采用his蛋白纯化柱纯化boIFN-，检测boIFN-的分泌浓度。最后取诱导上清和纯化boIFN-分别在VSV-GFP/MDBK和VSV-GFP/IBRS-2抗病毒系统中进行抗病毒活性检测，与同系统表达的poIFN-在上述系统中进行抗病毒活性比较分析。结果表明：优化后的boIFN-与原基因蛋白序列一致，优化后基因与原序列核酸同源性为73.1%，修改优化碱基134bp，共涉及110个氨基酸的编码，调整后的G+C含量为39.7%。优化基因opti-boIFN-克隆于载体pPIC9K中，测序鉴定重组质粒pPIC9K-opti-boIFN-构建成功。取诱导上清SDS-PAGE电泳发现：19kD处出现蛋白条带，与boIFN-大小相符，western blot鉴定发现，19kD处出现特异性条带，筛选获得高效分泌表达菌株。优化最佳诱导条件为：250r/min，26℃培养，1%甲醇浓度诱导，1.0OD/mL（2%转接量）转接浓度，诱导72h，浓度检测诱导上清中boIFN-最高可达200μg/mL。重组菌诱导上清和纯化boIFN-分别进行水疱型口炎病毒（VSV）抗病毒活性检测，发现诱导上清boIFN-和纯化boIFN-在MDBK细胞中抗病毒活性分别为2106AU/mL和107AU/mg，诱导上清boIFN-和纯化boIFN-在IBRS-2中的抗病毒活性分别是1105AU/mL和5105AU/mg，比较分析发现boIFN-在MDBK和IBRS-2细胞中均具有较高的抗病毒活性。本研究采用毕赤酵母高效分泌表达牛干扰素，为牛干扰素的产业化生产和临床应用奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-15
第一章 引言  15-25
  1.1 干扰素系统概述  15-18
    1.1.1 干扰素基因和蛋白  15-16
    1.1.2 信号转导和干扰素诱导基因的转录激活  16-17
    1.1.3 干扰素的生物学特性  17
    1.1.4 干扰素的应用前景  17-18
    1.1.5 牛干扰素研究进展  18
  1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统  18-23
    1.2.1 毕赤酵母的生物学特性  19-20
    1.2.2 巴斯德毕赤酵母工程菌的构建  20-21
    1.2.3 巴斯德毕赤酵母高效表达策略  21-23
    1.2.4 巴斯德毕赤酵母的应用与发展前景  23
  1.3 本研究的目的和意义  23-25
第二章 boIFN-α基因的优化  25-30
  2.1 材料与方法  25-26
    2.1.1 材料  25
    2.1.2 序列查找  25
    2.1.3 密码子优化  25
    2.1.4 碱基调整  25
    2.1.5 基因结构改造  25-26
  2.3 结果  26-29
    2.3.1 序列选择  26
    2.3.2 基因优化  26-29
  2.4 讨论  29-30
第三章 boIFN-α在毕赤酵母中的分泌表达  30-38
  3.1 材料与方法  30-33
    3.1.1 菌株、质粒与试剂  30
    3.1.2 培养基  30-31
    3.1.3 opti-boIFN-α基因的获得  31
    3.1.4 重组质粒 pPIC9K-opti-boIFN-α的构建  31
    3.1.5 电转化和筛选  31-33
    3.1.6 dot-blotting 和 SDS-PAGE 筛选  33
    3.1.7 western blot 验证  33
  3.2 结果  33-36
    3.2.1 重组质粒 pPIC9K-opti-boIFN-α的鉴定  33-34
    3.2.2 dot-blotting 筛选  34-35
    3.2.3 重组菌的 SDS-PAGE 检测  35
    3.2.4 重组菌的 western-blot 鉴定  35-36
  3.3 讨论  36-38
第四章 boIFN-α摇瓶发酵条件优化及其纯化  38-47
  4.1 材料和方法  38-40
    4.1.1 试剂和仪器  38
    4.1.2 培养基  38-39
    4.1.3 摇瓶发酵条件的优化  39-40
    4.1.4 生长曲线分析  40
    4.1.5 boIFN-α的纯化及定量分析  40
  4.2 结果  40-45
    4.2.1 摇瓶发酵条件优化  40-43
    4.2.2 boIFN-α的纯化  43-44
    4.2.3 目的蛋白的定量分析  44-45
  4.3 讨论  45-47
第五章 boIFN-α的抗病毒活性检测  47-54
  5.1 材料和方法  47-48
    5.1.1 病毒、细胞与试剂  47
    5.1.2 boIFN-α在不同细胞系中抗病毒活性检测  47
    5.1.3 boIFN-α与 boIFN-α抗病毒活性的比较  47-48
    5.1.4 boIFN-α的使用浓度检测  48
  5.2 结果  48-52
    5.2.1 boIFN-α抗病毒活性分析  48-50
    5.2.2 boIFN-α与 boIFN-α活性比较  50-51
    5.2.3 boIFN-α的使用剂量分析  51-52
  5.3 讨论  52-54
第六章 全文结论  54-55
参考文献  55-61
致谢  61-62
作者简介  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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