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产β-葡萄苷酶真菌的筛选鉴定及其酶的分离纯化和基因的克隆

作　者: 郝伟伟
导　师: 陈惠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 夹曲霉 β-葡萄糖苷酶 分离 纯化 酶学性项 基因克隆
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


β-葡萄糖苷酶是纤维素水解酶系的一个重要组分,它的活力大小严重影响纤维素酶水解纤维素的水平。近年来,随着在食品加工、饲料生产、医药和化工工业的广泛应用,β-葡萄糖苷酶得到越来越多的关注。本文以腐殖层土壤为样品,筛选出一株具有较高β-葡萄糖苷酶活力的米曲霉giF—10,对其进行了分离纯化和酶学性质研究,并克隆了其bgl基因,为进一步的表达奠定了基础。主要取得的结果如下：1.从雅安周公山腐殖层土壤中筛选出了三株具有纤维素酶酶活力的真菌。菌株giF-10的β-葡萄糖苷酶活力最高,为2.522U/mL。选取菌株giF-10为材料进行后续研究。形态学观察表明,菌落质地疏松,呈淡绿褐色,出现轮状的菌丝密实产孢区,分生孢子梗分枝较少,末端放射状,顶囊近球状,产生绿色孢子,孢子呈卵圆形。以giF-10基因组DNA为模板,PCR扩增得到长度为594bp的ITS序列,利用MEGA4.0软件以Neighbor-Joining计算方式生成基于ITS序列的系统发育进化树,分析证明giF-10Aspergillus oryzae strain UPM A22的序列同源性达100%,结合形态学观察结果将giF-10鉴定为米曲霉。2.对米曲霉giF-10进行摇瓶发酵,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析进行纯化,得到电泳纯的β-葡萄糖苷酶,其比活力为40.84U/mg。3.酶进行性质研究表明：纯化的酶的分子量约90kDa；该β-葡萄糖苷酶最适温度为55℃；在30-50℃时热稳定性好；最适pH为4.5;、pH4.0-6.0时稳定性好；金属离子对酶活力具有一定的影响,Mn2+对酶具有较强的激活作用；Fe3+和Cu2+对β-葡萄糖苷酶活力有较强的抑制作用；该酶对水杨素和纤维二糖具有较强的底物特异性；β-葡萄糖苷酶对水杨素的动力学参数：Km为0.676 mmol/L;对纤维二糖的动力学参数为：Km为2.906 mmol/L.4.根据Gene Bank中公布的Aspergillus oryzae RIB40基因组中β-葡萄糖苷酶基因设计引物,PCR扩增了菌株giF-10的bgl基因。序列分析表明该基因序列全长2903 bp,与数据库中来自Aspergillus oryzae RIB40的p-葡萄糖苷酶基因组序列的同源性达99%。该基因被5个内含子隔断,含一个长为2581 bp的ORF,编码865个氨基酸,N端30个氨基酸为信号肽。理论分子量为93.69 kDa。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 文献综述  9-18
  1.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选  10-11
  1.2 β-葡萄糖苷酶的酶学性质  11-14
  1.3 β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达  14-15
  1.4 β-葡萄糖苷酶的应用  15-16
  1.5 存在的问题  16-17
  1.6 本研究的前期工作、目的及意义  17-18
第二章 产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选与鉴定  18-29
  1 材料  18-20
    1.1 材料来源  18
    1.2 培养基  18
    1.3 分子生物学试剂  18-19
    1.4 主要药品  19
    1.5 主要仪器  19
    1.6 溶液配制  19-20
  2 方法  20-24
    2.1 菌种的筛选  20-21
    2.2 菌种的鉴定  21-24
  3 结果  24-27
    3.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选  24-25
    3.2 菌株鉴定  25-27
  4 讨论  27-29
第三章 米曲霉giF-10产β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质研究  29-44
  1 材料  29-31
    1.1 菌株  29
    1.2 生物试剂  29
    1.3 常用缓冲液  29-31
  2 方法  31-34
    2.1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化  31-32
    2.2 各步纯化的比活力和纯化倍数  32
    2.4 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究  32-34
  3 结果  34-41
    3.1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化  34-36
    3.2 各步纯化的比活力和纯化倍数  36-37
    3.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究  37-41
  4 讨论  41-44
第四章 β-葡萄糖苷酶基因的克隆  44-52
  1 材料  44-45
    1.1 菌株及载体  44
    1.2 培养基  44
    1.3 常用缓冲液  44-45
  2 方法  45-47
    2.1 bgl基因的克隆  45-47
  3 结果与分析  47-51
    3.1 bgl基因的克隆  47-51
  4 讨论  51-52
结论  52-53
参考文献  53-57
致谢  57

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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