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喹噁啉类对敏感大肠杆菌基因和蛋白质表达的影响研究

作　者: 李贝
导　师: 王玉莲
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 喹噁啉类药物喹赛多喹乙醇大肠杆菌抗菌作用基因芯片双向电泳 SOS基因
分类号: S859.79
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

喹噁啉类化合物(Quinoxalines)是一类人工合成的抗菌药,均属喹噁啉-1,4-二氧化物的衍生物,表现出很好的抗菌促生长效应。本实验室已经进行了喹噁啉类的体外抑菌试验以及喹噁啉类对畜禽常见致病菌引发的疾病的预防效果研究,说明该类药物的确具有有较强的抑菌效果,但是喹噁啉类化合物的抗菌机制至今未得到很好的揭示。目前只知道喹嗯啉类化合物喹多辛的抗菌作用方式是抑制细菌的DNA合成,但是其真正的DNA损伤机制和抗菌靶点需要进行更清楚深入的探讨。现今,基因组和蛋白组学技术已成为研究药物作用机理和靶点的新手段。本研究选取了喹噁啉类新药喹赛多和对喹赛多敏感的大肠杆菌作为研究对象,喹乙醇作为喹噁啉同类药物,通过基因芯片筛选出喹赛多和喹乙醇作用大肠杆菌前后的差异表达基因,分析与药物作用相关的基因以及药物对细菌生长繁殖、新陈代谢和毒力等多方面的影响,提出喹噁啉类药物抗菌机理假设,并确定药物可能的抗菌靶点。采用优化的大肠杆菌双向电泳-质谱鉴定技术考察喹赛多和喹乙醇作用大肠杆菌前后的差异蛋白,对差异基因结果提供补充和完善。对喹赛多和喹乙醇抗菌机理的研究将加快喹噁啉类药物的研发速度,为该药申报提供更全面的合乎国际和国内标准的资料,为日后的临床用药提供参考依据、为动物和人类用药安全提供保障。1.细菌的选择和药物作用浓度和时间的确定为了选择合适的敏感菌,分别在厌氧和有氧条件下,采用微量肉汤稀释法测定喹赛多和喹乙醇对动物源致病性大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)。结果表明在厌氧条件下喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌C84010的MIC为1μg/mL和4μg/mL,有氧条件下MIC都为16μg/mL,较其他几株菌C84010对喹赛多最为敏感,因此选择这株病原菌作为研究对象。其中在厌氧条件下,喹赛多和喹乙醇的抗菌活性明显提高,与已有文献关于喹噁啉类化合物厌氧条件下抗菌活性更高的报道一致,说明在厌氧条件下探讨喹嗯啉类药物的抗菌机制更有意义。为了找出与药物作用直接相关的基因和蛋白质以及药物浓度与基因变化之间的剂量关系,使用活菌计数法测定不同浓度药物处理后细菌的生长曲线,结果表明0.5MIC的喹赛多和1MIC的喹乙醇作用后,细菌的生长减慢,但是曲线仍然呈上升趋势；MBC的喹赛多和喹乙醇作用细菌30min后,90%的细菌死亡,因此确定药物浓度分别为0.5MIC、MBC的喹赛多(?)1MIC.MBC的喹乙醇,药物孵育时间为30min。2.喹赛多和喹乙醇作用大肠杆菌后的差异表达基因为了深入研究喹嗯啉类药物抗菌的分子作用机制,按照上述结果,选择用0.5MIC.MBC喹赛多和1MIC.MBC喹乙醇处理30min的大肠杆菌作为四个不同的药物处理组,1%DMSO处理相同时间后的大肠杆菌作为对照组,用芯片方法筛选药物作用后的差异表达基因,并对差异基因进行功能分类和蛋白质网络分析。从0.5MIC的喹赛多作用后的大肠杆菌中筛选出25个差异基因,全部呈显著的上调表达；从MBC的喹赛多作用后的大肠杆菌中筛选出55个差异基因,其中46个显著上调,9个显著下调。从MIC的喹乙醇作用后的大肠杆菌中筛选出166个差异基因,68个基因呈显著的上调,98个基因显著下调表达；从MBC的喹乙醇作用后的大肠杆菌中筛选出102个差异基因,其中81显著上调,21个显著下调。这些差异基因可以分为7大类,包括SOS基因、细胞膜相关基因、细胞毒性相关基因、物质合成代谢相关基因、细胞色素氧化酶基因、DNA转录调节基因和假定基因。其中四个药物处理组共同引起DNA损伤修复SOS基因的上调表达,SOS基因占0.5MIC喹赛多作用后差异基因的80%,且这些基因的变化倍数与药物浓度之间存在明显的剂量关系,表明喹赛多和喹乙醇对细菌的DNA有明显的损伤作用。推测喹赛多和喹乙醇在厌氧条件下经过还原代谢激活反应产生的芳香族自由基中间体会作用于DNA核糖上的C1位,造成大肠杆菌内DNA的断裂损伤。MBC的喹赛多和喹乙醇对细菌DNA损伤后,大量细菌死亡,部分存活下来的细菌需启动抗应激相关的调控基因(yjbJ,mar A),调控多种基因的表达以适应环境的急剧改变,如减慢蛋白质合成速度(yafO),关闭鞭毛的运动性(fliM),减弱细胞膜运输物质的功能(RbSC、proV和treB)等,同时引起外排泵基因(ydhC)的上调表达,将喹赛多和喹乙醇排出细菌外。3.喹赛多和喹乙醇作用大肠杆菌后的差异表达蛋白为了从蛋白质翻译水平补充和完善差异基因的结果,采用优化的大肠杆菌双向电泳方法,筛选喹赛多和喹乙醇作用细菌后的差异表达蛋白。差异蛋白的功能主要是与DNA修复、抗氧化应激、蛋白质合成、细菌形态和细菌毒性等相关。LexA蛋白的下调表达与基因芯片结果中lexA的上调表达相反,是基于LexA的自降解活性,LexA自剪切后激活SOS基因表达；在蛋白水平上发现了另外的抗氧化应激蛋白Ssb和YgfZ上调表达,保护细菌DNA免受氧化损伤；蛋白质合成延伸因子下调表达,与芯片结果中蛋白质翻译抑制基因的上调表达结果一致,推测细菌在药物作用下,关闭蛋白质合成直至恢复正常生长；另外决定大肠杆菌形态的MreB蛋白下调,提示药物作用后细菌形态的改变,与基因芯片结果中sulA上调表达导致细菌成丝状的现象一致。综上所述,本研究采用基因芯片和双向电泳技术发现大量DNA损伤修复基因和蛋白的差异表达,表明在厌氧条件下这两种喹噁啉类药物通过还原激活反应产生的中间体自由基对细菌DNA造成了严重损伤,从而发挥抗菌作用。同时药物对细菌DNA产生的损伤作用,直接或间接地影响了细菌各个方面的正常代谢活动。因此,本课题的研究成果为进一步研究喹噁啉类药物的抗菌靶点和抗菌机制提供全面而系统的理论基础。

全文目录

摘要  8-11
Abstract  11-15
缩略语表  15-16
1 前言  16-20
  1.1 立题依据  16
  1.2 国内外研究现状与发展趋势  16-19
  1.3 目的意义  19-20
2 材料与方法  20-36
  2.1 实验菌株及来源  20
  2.2 主要试剂及来源  20-21
  2.3 主要试剂配制  21-23
  2.4 主要仪器及来源  23-24
  2.5 药物作用合适浓度和时间的测定  24-25
    2.5.1 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定  24-25
    2.5.2 大肠杆菌生长曲线的测定  25
    2.5.3 喹赛多抑菌和杀菌曲线的测定  25
    2.5.4 喹乙醇抑菌和杀菌曲线的测定  25
  2.6 药物作用后差异基因的检测(基因芯片)  25-29
    2.6.1 细菌总RNA提取  25-26
    2.6.2 芯片检测cDNA合成与芯片杂交  26-27
    2.6.3 基因芯片的数据分析  27-28
    2.6.4 Real-Time PCR验证部分差异基因  28-29
  2.7 大肠杆菌蛋白质二维电泳条件优化  29-34
    2.7.1 大肠杆菌蛋白的提取  29-30
    2.7.2 二维凝胶电泳  30-33
    2.7.3 蛋白点的胶内酶解和质谱鉴定  33-34
  2.8 药物作用后大肠杆菌差异蛋白的筛选  34-36
    2.8.1 药物作用后蛋白质的提取  34
    2.8.2 二维电泳和差异蛋白点的检测  34-35
    2.8.3 差异蛋白点的酶解与MALDI-TOF质谱鉴定  35-36
3 结果与分析  36-76
  3.1 药物作用合适的浓度和时间  36-39
    3.1.1 不同大肠杆菌对喹赛多和喹乙醇的敏感性  36
    3.1.2 细菌加药的最适时间  36-37
    3.1.3 喹赛多作用的最佳浓度  37-38
    3.1.4 喹乙醇作用的最佳浓度  38-39
  3.2 喹赛多和喹乙醇作用后大肠杆菌的差异基因分析(基因芯片)  39-65
    3.2.1 大肠杆菌的总RNA质量  39-40
    3.2.2 芯片质量与结果的可靠性分析  40-42
    3.2.3 喹赛多作用后的大肠杆菌差异表达基因  42-58
    3.2.4 喹乙醇作用后的大肠杆菌差异表达基因  58-63
    3.2.5 喹赛多和喹乙醇共同的差异表达基因  63
    3.2.6 实时荧光定量PCR验证芯片结果  63-65
  3.3 大肠杆菌蛋白质二维电泳体系的建立  65-68
    3.3.1 不同样品提取方法下蛋白质的分离情况(银染)  65
    3.3.2 不同样品提取方法下蛋白质的分离情况(考染)  65-66
    3.3.3 等电聚焦程序改良后的蛋白质分离情况  66
    3.3.4 蛋白点的分离与质谱鉴定分析  66-68
  3.4 药物作用后差异蛋白的检测(宽范围胶条)  68-71
    3.4.1 二维电泳凝胶上差异蛋白点的检测  68-69
    3.4.2 差异蛋白点的鉴定分析  69-71
  3.5 药物作用后差异蛋白的检测(窄范围胶条)  71-76
    3.5.1 二维电泳凝胶上差异蛋白点的检测  71-73
    3.5.2 差异蛋白点的鉴定分析  73-76
4 讨论  76-83
  4.1 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌基因表达的影响  76-78
  4.2 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌蛋白质表达的影响  78-83
5 全文总结  83-84
6 文献综述  84-98
参考文献  98-106
致谢  106-107
附录1---研究生简介  107-108
附录2—原始数据  108-125
答辩委员提问与回答  125-126

喹噁啉类对敏感大肠杆菌基因和蛋白质表达的影响研究

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