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一氧化氮作用前后角质形成细胞差异蛋白的筛选与分析

作　者: 张宇恒
导　师: 刘晓明
学　校: 大连医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: NO HaCaT细胞人角质形成细胞双向电泳质谱分析
分类号: R758.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:研究一氧化氮(NO)对体外培养的永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)及人原代培养的角质形成细胞(KC)蛋白质表达的影响,在蛋白水平上寻找NO作用的靶位。进一步探讨NO在银屑病发病中的地位和作用。方法:体外培养HaCaT细胞及人原代KC,通过CCK-8法检测不同浓度外源性NO供体S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)作用后,在不同时间点的细胞增殖率,绘制浓度与细胞增值率曲线,筛选最佳GSNO浓度。向处于指数增长期的HaCaT细胞及人原代KC中加入最佳浓度的GSNO进行刺激。对照组不予处理。加药处理的细胞和对照组用细胞裂解液分别进行充分裂解,提取细胞全蛋白。应用2-D纯化试剂盒进行蛋白纯化,蛋白定量。纯化后的蛋白中加入上样缓冲液制成样本,首先进行第一向等电聚焦电泳,胶条的平衡,再进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成的凝胶进行硝酸银染色,图像扫描,用PD-QUEST8.0软件进行分析,筛选出加入GSNO前后的差异点,切下进行质谱分析,对蛋白质种类进行鉴定。结果: (1)应用CCK-8法,绘制GSNO浓度与细胞增值率曲线显示,随着GSNO浓度的增加,细胞增殖呈下降趋势,与时间无显著关系。(2)HaCaT细胞组及人KC组进行双向电泳后出点良好;加入GSNO前、后HaCaT细胞组平均蛋白质点数分别为482±31,,495±28,组内匹配率达82.1%和81.9%;加入GSNO前、后人KC组平均蛋白质点数分别为543±27和529±29,匹配率为80.8%和81.4%。(3)差异蛋白点数总共为29个,其中,2个点仅在加入GSNO后表达;14个点在加入GSNO后高表达;13个点在加入GSNO后地表达或消失;进行质谱分析,检测到17种已知蛋白,3种未知蛋白。结论:(1)该研究建立了NO作用前、后HaCaT细胞及人KC的双向电泳图谱,发现二者之间存在差异表达蛋白; (2)本研究通过NO作用前后HaCaT细胞及人KC的双向电泳及质谱分析,发现抑制素、角蛋白、肌动蛋白结合蛋白等17种差异表达的蛋白; (3)NO通过调节多种靶向蛋白的表达,调节KC增殖周期、分化或凋亡,介导早期银屑病的炎性反应。

一氧化氮作用前后角质形成细胞差异蛋白的筛选与分析

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