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非洲猪瘟病毒VP72基因检测方法的建立及VP73蛋白研究

作　者: 李洪利
导　师: 曹金山; 王君玮
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 非洲猪瘟 实时荧光定量PCR 原核表达 多克隆抗体
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)是一种强传染性的病毒,可引起家猪的急性、致死性传染病。对养猪业可造成巨大的经济损失。本研究成功建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法,并制备了VP73主要抗原表位区融合蛋白的多克隆抗体,为非洲猪瘟VP73蛋白后续免疫学研究奠定了基础。为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、mg2+浓度和引物探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60℃,mg2+终浓度为4mmol/L,引物探针终浓度分别为0.8μmol/L和0.3μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0mmol/,诱导5h蛋白表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为42kD。蛋白纯化后,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1：1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-11
1 绪论  11-19
  1.1 病原学  11
  1.2 ASF的流行病学  11-13
    1.2.1 森林循环  11-12
    1.2.2 家猪  12
    1.2.3 森林循环和家猪间的传播  12
    1.2.4 分子流行病学  12-13
    1.2.5 ASF传入亚洲的风险分析  13
  1.3 ASFV感染机制  13-17
    1.3.1 病毒侵入宿主细胞的胞吞机制  13-14
    1.3.2 ASFV在侵入宿主细胞后的DNA复制机制  14-15
    1.3.3 参与ASFV装配过程的蛋白及装配机制  15-16
    1.3.4 成熟病毒粒子向胞外的运输与释放机制  16
    1.3.5 与病毒毒力有关的蛋白及其作用  16-17
    1.3.6 参与ASFV逃避宿主免疫防御机制的蛋白及其作用机制  17
  1.4 ASFV检测方法  17-19
    1.4.1 病毒核酸检测  18-19
    1.4.2 酶联免疫吸附法(ELISA)  19
2 ASFV实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用  19-30
  2.1 材料和方法  19-23
    2.1.1 材料  19-20
    2.1.2 方法  20-23
  2.2 实验结果  23-28
    2.2.1 引物和探针的设计  23
    2.2.2 pMD18T-316质粒的PCR扩增  23
    2.2.3 实时荧光定量PCR退火温度的优化  23-25
    2.2.4 Mg2+浓度的优化  25
    2.2.5 引物探针浓度的优化  25
    2.2.6 标准曲线的建立  25-26
    2.2.7 重复性试验  26-27
    2.2.8 敏感性试验  27
    2.2.9 特异性试验  27-28
    2.2.10 样品检测  28
  2.3 讨论  28-30
3 ASFV VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备  30-43
  3.1 材料  30-32
    3.1.1 质粒  30
    3.1.2 试剂及材料  30-31
    3.1.3 仪器  31
    3.1.4 常用试剂配制  31-32
    3.1.5 实验动物  32
  3.2 方法  32-38
    3.2.1 ASFV VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达  32-36
    3.2.2 VP73主要抗原区融合蛋白多克隆抗体的制备  36-38
  3.3 结果  38-41
    3.3.1 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定  38-39
    3.3.2 重组质粒的序列测定  39
    3.3.3 重组质粒pET32a-VP73的诱导时间优化  39
    3.3.4 VP73融合蛋白的大量表达与纯化  39-40
    3.3.5 VP73融合蛋白的Western Blot鉴定  40-41
    3.3.6 VP73主要抗原表位区蛋白的免疫特异性测定  41
    3.3.7 间接ELISA效价测定多克隆抗体  41
  3.4 讨论  41-43
4 结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-52
作者简介  52

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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