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大鼠周期黄体中NSE的表达及山羊NSE基因CDS的克隆

作　者: 孟霞
导　师: 陈树林
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大鼠山羊黄体神经元特异性烯醇化酶克隆
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为了研究大鼠黄体中神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达情况，揭示其与黄体细胞生长凋亡的关系，本实验用RT-PCR、免疫组化、免疫细胞化学、原位杂交等方法同时从mRNA水平和蛋白水平对大鼠黄体组织和体外培养的黄体细胞中NSE的表达进行了研究，并对NSE对体外培养的大鼠黄体细胞生长的影响进行了初步研究。同时，本实验还对山羊NSE基因的CDS区进行了克隆并对其序列进行了分析。主要结果如下：1. RT-PCR、免疫组化、免疫细胞化学、原位杂交等结果表明，无论是在黄体组织还是在体外培养的大鼠黄体细胞中都存在NSE mRNA和蛋白的阳性表达。2.通过在大鼠黄体细胞培养液中加入不同浓度的NSE及其抗体，利用灰度值半定量方法分析不同实验组中Bcl-2和Bax的相对表达量和Bcl-2/Bax的比值及NSE的相对表达量，我们发现，黄体细胞培养液中含NSE时，bcl-2/bax的比值要大于空白对照组，且随着NSE浓度的升高，bcl-2/bax的比值逐渐增大；培养液中含NSE抗体时，bcl-2/bax的比值要小于空白对照组。同时，随着培养液中NSE浓度的升高，细胞NSE的相对表达量逐渐升高；相反，培养液中含NSE抗体时，细胞NSE的相对表达量明显低于对照组。综上所述，NSE能促进黄体细胞中bcl-2/bax比值的增大，可能具有促进黄体细胞生长抑制细胞凋亡的作用。3.通过克隆测序，本实验确定了山羊NSE基因的CDS区序列（GenBank登陆号:JN887466）并对其进行了生物信息学分析。奶山羊NSE基因CDS区核苷酸序列与牛、大鼠、小鼠和人的同源性分别为97.9%,89.3%,90%和92.6%,其氨基酸序列与牛、大鼠、小鼠和人的同源性分别为99.1%,97%,97.2%和98.2%。这些结果首次表明NSE基因编码的功能氨基酸在山羊、牛、大鼠、小鼠和人上高度保守，山羊NSE基因与其他物种的NSE基因具有很高的同源性。综上所述，本实验证明大鼠黄体组织和细胞中均存在NSE mRNA和蛋白的表达，且NSE能促进黄体细胞中bcl-2/bax比值的增大，可能具有促进黄体细胞生长抑制细胞凋亡的作用，初步揭示了NSE与黄体细胞生长凋亡的关系；本实验还成功克隆了山羊NSE基因的CDS，并对其生物信息学进行了分析，为以后通过RNAi技术敲除NSE基因深入研究其功能及其与黄体细胞凋亡的关系提供理论依据，同时，也丰富了山羊的遗传学信息。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-11
文献综述  11-26
  第一章哺乳动物黄体研究进展  11-19
    1.1 黄体的发育与调节  11-13
      1.1.1 黄体的发育形成过程  11
      1.1.2 黄体的组成与分类  11-12
      1.1.3 黄体的形成过程及其间的分子生物学变化  12-13
    1.2 黄体的功能与调节  13-15
      1.2.1 黄体合成类固醇激素  13
      1.2.2 黄体功能的调节  13-15
    1.3 黄体的退化  15-19
      1.3.1 黄体的功能性退化  15
      1.3.2 黄体的结构性退化  15-19
  第二章神经元特异性烯醇化酶研究进展  19-22
    2.1 神经元特异性烯醇化酶的理化特性  19
    2.2 神经元特异性烯醇化酶的生物学功能  19-22
      2.2.1 神经元营养和保护作用  19-20
      2.2.2 促生长作用  20-22
  第三章 17Β羟基类固醇脱氢酶 7 研究进展  22-26
    3.1 17ΒHSD-7 的理化特性  22-23
    3.2 17ΒHSD-7 的生物学功能  23-24
      3.2.1 雌二醇生成中的作用  23-24
      3.2.2 胆固醇生物合成中的作用  24
    3.3 17ΒHSD-7 表达的调控  24-25
      3.3.1 黄体生成素（LH）  24-25
      3.3.2 雌二醇  25
      3.3.3 PRL  25
    3.4 展望  25-26
试验研究  26-53
  第四章 NSE 在大鼠黄体组织和细胞中的表达  26-37
    4.1 材料与方法  26-32
      4.1.1 实验动物  26
      4.1.2 主要仪器设备及试剂  26-27
      4.1.3 实验所用溶液及配制  27-28
      4.1.4 大鼠的诱导发情、超数排卵和黄体组织的采集、处理  28-29
      4.1.5 免疫组织化学 SP 法染色程序  29
      4.1.6 原位杂交染色程序  29-30
      4.1.7 黄体细胞培养  30
      4.1.8 免疫细胞化学染色  30
      4.1.9 显微摄影  30
      4.1.10 Trizol 法提取黄体组织和细胞的 RNA  30-31
      4.1.11 RT-PCR  31-32
    4.2 结果  32-35
      4.2.1 黄体组织免疫组化染色结果  32-33
      4.2.2 黄体细胞免疫化学染色结果  33
      4.2.3 黄体组织原位杂交结果  33-34
      4.2.4 黄体组织 RT-PCR 扩增结果  34
      4.2.5 黄体细胞 RT-PCR 扩增结果  34-35
    4.3 讨论  35-36
    4.4 小结  36-37
  第五章不同浓度 NSE 对体外培养的大鼠黄体细胞生长的影响  37-42
    5.1 材料与方法  37-39
      5.1.1 实验动物  37
      5.1.2 主要仪器设备及试剂  37
      5.1.3 实验所用溶液及配制  37
      5.1.4 引物的设计与合成  37-38
      5.1.5 大鼠的诱导发情、超数排卵和黄体组织的采集、处理  38
      5.1.6 黄体细胞的原代培养  38
      5.1.7 NSE 及其抗体对黄体细胞生长的影响  38-39
    5.2 结果  39-41
    5.3 讨论  41
    5.4 小结  41-42
  第六章山羊 NSE 基因 CDS 的克隆及序列分析  42-53
    6.1 材料  42-43
      6.1.1 实验动物  42
      6.1.2 菌株和载体  42
      6.1.3 生化与分子生物学试剂  42-43
      6.1.4 主要仪器  43
    6.2 方法  43-46
      6.2.1 扩增和鉴定山羊 NSE 基因 CDS 用 PCR 引物的合成  43
      6.2.2 Trizol 法提取山羊黄体组织的 RNA  43
      6.2.3 RT-PCR  43-44
      6.2.4 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物的回收与纯化  44
      6.2.5 pMD18-T 载体与回收片段的连接反应  44-45
      6.2.6 连接产物转化 DH5α感受态  45
      6.2.7 转基因载体的鉴定  45-46
    6.3 结果  46-51
      6.3.1 山羊 NSE 基因 CDS 区的扩增结果  46-47
      6.3.2 载体双酶切鉴定结果  47
      6.3.3 山羊 NSE 基因 CDS 测序结果  47-48
      6.3.4 山羊 NSE 基因 CDS 的序列分析结果  48-51
    6.4 讨论  51
    6.5 小结  51-53
结论  53-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
作者简介  63

大鼠周期黄体中NSE的表达及山羊NSE基因CDS的克隆

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