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胡杨PeTPK1与PeGPX基因转化及耐盐性功能研究

作　者: 王菲菲
导　师: 陈少良
学　校: 北京林业大学
专　业: 植物学
关键词: 胡杨耐盐性转基因 PeTPK1 PeGPX
分类号: S792.119
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

盐胁迫是抑制植物生长和降低农作物产量的主要环境因素之一。长期以来,关于如何提高植物的抗盐性和增加在盐胁迫下农作物的产量一直是人们关注的焦点。胡杨(Populus euphratica Olive)是中国西北沙漠干旱盐碱地区广泛分布的一个抗盐树种,它常常与一些盐生灌木组成沙漠植被生态系统。目前对于胡杨的耐盐性已经有很多研究,但是对于胡杨具体的耐盐分子机理方面的研究还不深入。据此,我们以耐盐的胡杨为材料,克隆其在盐胁迫下表达上调的TPK型钾离子通道(PeTPK1)基因以及GPX抗氧化酶(PeGPX)基因,通过分别在烟草BY-2细胞以及烟草植株中过表达这两个基因的方法,来深入研究这两个基因在胡杨应对盐胁迫过程中发挥作用。具体研究结果和结论如下：1.胡杨TPK型钾离子通道基因研究结果显示克隆得到的PeTPK1基因ORF全长为990bp,其蛋白由330个氨基酸组成,该序列包含钾离子通道P结构域的保守序列TXGYGD。在烟草BY-2细胞中过表达该基因,能够增加烟草细胞的抗盐性但没有增加其抵抗渗透胁迫的能力。在盐胁迫(NaCl100mM和150mM)三周后,转基因烟草细胞的鲜重及干重明显高于野生型烟草细胞。在短期盐胁迫下(100mM NaCl,24h),转基因烟草细胞的细胞活力比野生型的高,而膜透性比野生型的低,并且差异显著。离子含量测定结果显示,相对于野生型烟草细胞,转基因烟草细胞的钠离子含量上升幅度小,钾离子含量下降较少。非损伤微测技术检测在盐胁迫下转基因、野生型烟草细胞及原生质体的钾离子流的动态变化,结果显示：盐胁迫下,转基因细胞及其原生质体相对于野生型都有明显的钾离子外流现象。鉴于PeTPK1基因的亚细胞定位研究显示,该基因定位于在液泡膜上,我们推测盐诱导的烟草细胞及其原生质体的钾离子外流,很可能是通过PeTPK1钾离子通道介导的。在该钾离子通道的作用下,液泡中的钾离子转运到细胞质中以保持细胞质中钾离子的平衡,从而增加了烟草细胞的抗盐性。2.胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因PeGPX研究结果显示,实验中克隆的cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其ORF为693bp,其蛋白由231个氨基酸编码的疏水性蛋白。过量表达PeGPX基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在含NaCl (200mM/L)的MS培养基中生长15天后,无明显的长高,且不长根；而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达PeGPX基因烟草的净光合速率比野生型烟草的受到影响较小。酶活数据显示,转基因株系GPX酶活在盐胁迫下活性有非常显著的提高。以上数据说明：过表达PeGPX基因使得烟草的耐盐性得到显著提高。综上所述,我们的实验结果显示,转化PeTPK1基因的烟草BY-2细胞其抗盐性明显比野生型要高,我们推测该基因对于烟草细胞中钾离子的平衡起到了重要的作用。转化的PeGPX基因使得烟草的耐盐性比野生型烟草有明显的提高,我们推测该基因对于盐胁迫下烟草的抗氧化调节发挥了重要的功能。实验结果对解释胡杨耐盐机制,认识PeTPK1和PeGPX基因的功能具有重要意义。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-11
缩写词  11-12
引言  12-14
1 文献综述  14-24
  1.1 植物的耐盐机制  14-16
    1.1.1 离子平衡的调控机制  14-15
      1.1.1.1 离子的区域化  14-15
      1.1.1.2 拒盐作用以及对离了的选择吸收  15
    1.1.2 盐胁迫下活性氧平衡的调控机制  15-16
  1.2 胡杨耐盐性机制的研究进展  16-19
    1.2.1 胡杨离子平衡的调控机制  16-19
  1.3 钾离了平衡对于植物耐盐性的影响  19
  1.4 钾离子通道研究进展  19-21
    1.4.1 钾离子通道概况  19-21
      1.4.1.1 Shaker家族通道  20-21
      1.4.1.2 TPK家族通道  21
      1.4.1.3 Kir型通道  21
    1.4.2 钾离子通道功能以及与耐盐性关系  21
  1.5 TPK1钾离子通道研究进展  21-23
    1.5.1 TPK1钾离子通道概况  21-22
    1.5.2 TPK1功能以及与耐盐性关系  22-23
  1.6 GPX研究现状  23
    1.6.1 GPX概况  23
    1.6.2 GPX功能以及与耐盐性关系  23
  1.7 本研究的目的与意义  23-24
2 胡杨TPK1基因参与胡杨耐盐性的研究  24-42
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 植物材料与培养  24
    2.1.2 实验使用仪器  24-25
    2.1.3 分子生物实验使用试剂  25
  2.2 实验方法  25-29
    2.2.1 胡杨TPK1基因的克隆以及转基因株系的获得  25-26
      2.2.1.1 PeTPK1基因的克隆  25
      2.2.1.2 PeTPK1植物表达载体构建  25
      2.2.1.3 PeTPK1植物表达载体转入农杆菌  25-26
      2.2.1.4 农杆菌介导法侵染烟草细胞  26
    2.2.2 转化株系的初步鉴定以及转基因的表达量分析  26
      2.2.2.1 转化株系的初步鉴定  26
      2.2.2.2 转化基因的表达量分析  26
    2.2.3 PeTPK1转基因细胞的耐盐性以及渗透胁迫实验测定  26-27
    2.2.4 PeTPK1转基因烟草细胞的细胞活力以及膜透性检测  27
    2.2.5 烟草细胞离子含量测定  27
    2.2.6 烟草细胞原生质体的游离  27-28
    2.2.7 离子流测定  28-29
      2.2.7.1 电极制作  28
      2.2.7.2 校止  28
      2.2.7.3 采样规则  28
      2.2.7.4 原生质体的固定  28
      2.2.7.5 K~1流的测定  28-29
      2.2.7.6 数据分析  29
    2.2.8 PeTPK1基因的亚细胞定位  29
      2.2.8.1 PeTPK1定位载体构建  29
      2.2.8.2 亚细胞定位  29
  2.3 实验结果  29-40
    2.3.1 PeTPK1基因的克隆以及生物信息学分析  29-33
      2.3.1.1 PeTPK1基因的克隆以及序列分析  29-31
      2.3.1.2 同源性分析  31-32
      2.3.1.3 膜预测  32-33
    2.3.2 PeTPKl植物表达载体构建  33
    2.3.3 PeTPK1转基因烟草细胞的初步鉴定以及表达量分析  33
    2.3.4 PeTPK1转基因烟草细胞的耐盐性以及渗透胁迫实验  33-35
    2.3.5 盐胁迫下转基因细胞的细胞活力以及膜透性  35-36
    2.3.6 盐处理对转基因细胞以及野生型烟草细胞的离子含量的影响  36-38
    2.3.7 钾离子流  38-39
    2.3.8 PeTPK1基因亚细胞定位  39-40
      2.3.8.1 PeTPK1定位载体构建  39
      2.3.8.2 PeTPK1定位在液泡膜上  39-40
  2.4 时论  40-42
    2.4.1 PeTPK1基因的表达增加了BY-2烟草细胞的抗盐性  40-41
    2.4.2 PeTPK1基因表达参与盐胁迫下烟草细胞中的钾离子平衡  41-42
3 胡杨GPX基因参与胡杨耐盐性的研究  42-54
  3.1 实验材料  42
  3.2 实验方法  42-45
    3.2.1 PeGPX基因的克隆  42
    3.2.2 PeGPX基因转入农杆菌并侵染烟草  42-43
      3.2.2.1 PeGPX载体构建  42
      3.2.2.2 PeGPX转入农杆菌  42
      3.2.2.3 农杆菌介导法侵染烟草  42-43
    3.2.3 转化株系的初步鉴定以及转化基因的表达量分析  43
      3.2.3.1 PeGPX转基因烟草的初步鉴定  43
      3.2.3.2 PeGPX转基因烟草表达量分析  43
    3.2.4 转基因烟草的盐处理  43
    3.2.5 光合数据测定  43-44
    3.2.6 酶活检测  44-45
      3.2.6.1 酶提取液  44
      3.2.6.2 SOD活性的测定  44
      3.2.6.3 CAT活性测定  44
      3.2.6.4 APX活性测定  44
      3.2.6.5 GPX活性测定  44-45
      3.2.6.6 蛋白质含量测定  45
  3.3 实验结果  45-52
    3.3.1 PeGPX基因的克隆以及序列分析  45-47
    3.3.2 PeGPX植物表达载体构建及转化烟草  47-48
    3.3.3 PeGPX转基因烟草的初步鉴定以及表达量分析  48
      3.3.3.1 PeGPX转基因烟草的初步鉴定  48
      3.3.3.2 PeGPX转基因烟草表达量分析  48
    3.3.4 PeGPX转基因烟草的耐盐性  48-50
    3.3.5 PeGPX转基因烟草的光和参数测定  50-51
    3.3.6 PeGPX转基因烟草酶活测定  51-52
  3.4 讨论  52-54
4 结论与展望  54-56
  4.1 结论  54-55
  4.2 展望  55-56
参考文献  56-64
个人简介  64-66
硕士在读期间成果清单  66-68
导师简介  68-70
致谢  70

胡杨PeTPK1与PeGPX基因转化及耐盐性功能研究

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