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位点特异重组系统在杨树选择标记基因删除中的应用

作　者: 孙艳
导　师: 戴绍军; 魏建华
学　校: 东北林业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 转基因生物安全位点特异重组系统 Hsp18.2
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

杨树是我国广泛栽培的重要树种之一。在生态建设、城市绿化和木材生产中发挥着不可替代的巨大作用。利用常规育种手段往往不能有效地定向培育新品种,因此转基因技术已成为杨树遗传改良的一种非常有效的手段。随着转基因技术的在育种中的应用,它的生物安全性问题引起人们越来越多的关注。本研究以新型位点特异重组系统为基础,采用loxFRT融合识别位点代替传统的单识别位点lox或FRT,利用物理诱导性启动子和化学诱导性启动子精确控制重组酶FLP表达,建成一套新型安全高效的杨树转基因技术,高效地删除转基因杨树中可能带来生物安全性问题的选择标记基因,从根本上防止转基因通过花粉逃逸,为转基因杨树的大面积推广奠定基础。具体取得以下结果：(1)通过基因枪法转化结缕草愈伤检测gus基因的瞬时表达,验证了pLFGNHFLP载体和pLFGNXVE载体遗传转化系统的可行性。(2)利用农杆菌介导法将pLFGNHFLP载体和pLFGNXVE载体转入杨树,分别获得了23株和48株PCR阳性植株。对转pLFGNHFLP基因植株的13个株系进行热激处理,获得5株无选择标记基因的转基因杨树。对转pLFGNXVE基因植株的4个株系进行4种不同浓度的17-β-雌二醇处理,获得4株无选择标记基因的转基因杨树。筛选出转pLFGNXVE基因杨树中诱导重组酶表达的17-β-雌二醇的最适浓度。(3)构建了含有抗虫基因的标记基因删除载体PYL3cry3A。农杆菌介导法将PYL3cry3A载体转入杨树,最后获得了24株PCR阳性植株。对转PYL3cry3A基因植株的24个株系用mBt-Cry3A ImmunoStrip进一步检测,获得1株有蛋白表达的植株。对24个株系进行热激处理,获得8株无选择标记基因的转基因抗虫杨树。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 绪论  8-15
  1.1 引言  8-15
    1.1.1 转基因植物的生物安全性问题  8-9
    1.1.2 目前解决转基因植物生物安全性的方法  9-13
    1.1.3 展望  13
    1.1.4 本研究的立题依据和技术路线  13-15
2 拟南芥热激启动子驱动重组酶表达的标记基因删除系统  15-26
  2.1 引言  15
  2.2 实验材料  15-16
    2.2.1 植物材料  15
    2.2.2 菌株与载体  15
    2.2.3 培养基  15
    2.2.4 生化试剂  15-16
  2.3 实验方法  16-21
    2.3.1 质粒DNA的提取  16
    2.3.2 基因枪法转化结缕草愈伤  16-17
    2.3.3 农杆菌C58介导的双元植物表达载体pLFGNHFLP的转化  17-19
    2.3.4 再生植株的PCR检测  19-20
    2.3.5 标记基因的删除  20-21
  2.4 结果与分析  21-24
    2.4.1 GUS在结缕草愈伤中的瞬时表达  21-22
    2.4.2 转基因杨树的PCR检测  22
    2.4.3 标记基因的删除  22-24
  2.5 讨论  24-25
  2.6 本章小结  25-26
3 雌二醇驱动重组酶表达的标记基因删除系统  26-32
  3.1 引言  26
  3.2 实验材料  26-27
    3.2.1 植物材料  26
    3.2.2 菌株与载体  26
    3.2.3 培养基  26
    3.2.4 生化试剂  26-27
  3.3 实验方法  27
    3.3.1 标记基因的删除  27
  3.4 结果与分析  27-30
    3.4.1 GUS在结缕草愈伤中的瞬时表达  27-28
    3.4.2 转基因杨树的PCR检测  28-29
    3.4.3 标记基因的删除  29-30
  3.5 讨论  30-31
  3.6 本章小结  31-32
4 含有抗虫基因的标记基因删除系统  32-39
  4.1 引言  32
  4.2 实验材料  32-33
    4.2.1 植物材料  32
    4.2.2 菌株与载体  32
    4.2.3 培养基  32
    4.2.4 生化试剂  32-33
  4.3 实验方法  33-34
    4.3.1 质粒DNA的提取  33
    4.3.2 表达载体的构建  33
    4.3.3 农杆菌C58介导的双元植物表达载体PYL3cry3A的转化  33
    4.3.4 再生植株的PCR检测  33
    4.3.5 mBt-Cry3A ImmunoStrip检测  33-34
    4.3.6 标记基因的删除  34
  4.4 结果与分析  34-37
    4.4.1 表达载体的构建  34-35
    4.4.2 转基因杨树的PCR检测  35-36
    4.4.3 mBt-Cry3A ImmunoStrip检测  36
    4.4.4 标记基因的删除  36-37
  4.5 讨论  37
  4.6 本章小结  37-39
结论  39-40
参考文献  40-46
攻读学位期间发表的学术论文  46-47
致谢  47-48

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