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根癌农杆菌介导ALA合酶基因转化‘红颊’草莓的研究

作　者: 林晓慧
导　师: 汪良驹
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 红颊 5-氨基乙酰丙酸(ALA) 叶片再生 YHem1基因转基因高温胁迫
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

草莓(Fragaria ananassa Duch.)在园艺学上属于小型浆果类果树。近年来,设施草莓栽培已经成为许多地区农业生产的特色产业。但有些草莓品种耐热耐湿能力较弱,且病虫害发生程度严重,严重制约了草莓经济效益的提高,因此,如何提高草莓耐热耐湿能力是解决好草莓产业化的关键问题。5-氨基乙酰丙酸(ALA)具有提高植物抗逆性效应。在动物及酵母中,ALA合酶是ALA合成的限速酶。酵母中,ALA合酶由HemA基因编码；拟南芥中ALA生物合成的关键酶GluTR由HemAl基因编码,并受到光敏型启动子调控。本研究将拟南芥HemAl基因启动子控制的酿酒酵母ALA合酶基因Heml重组基因YHeml转入草莓叶片外植体中,通过Km筛选、GUS染色、PCR、Southern杂交、RT-PCR以及内源ALA含量检测,筛选出3株ALA过量合成系株系,并且证明,外源基因转入有利于提高高温胁迫下草莓叶片光合能力,从而为草莓耐高温新品种选育奠定了基础。现将主要试验结果介绍如下。1.以‘红颊’草莓试管苗叶片为外植体,建立叶片再生体系。结果表明,草莓叶片不定芽诱导率为82.5%,MS为基本培养基,添加1.5 mg/L TDZ、0.4 mg/L IB A和1.0 mg/L AgNO3,有利于不定芽再生。草莓叶片再生以颜色淡绿、幼嫩、厚实,苗龄15-30d的叶片为好,暗培养1-2周可促进草莓叶片再生。不定芽置于MS+NAA 0.5mg/L中生根一个月,可形成完整再生植株。2.通过对影响草莓转化效率的菌液浸染时间、卡那霉素浓度及乙酰丁香酮浓度等因素进行比较试验,建立了农杆菌介导的Yheml基因转化草莓叶片的遗传转化体系。结果表明OD600=0.4-0.5的MS悬浮菌液中浸染5min, MS+1.5 mg/L TDZ+0.4 mg/L IBA+100μmol/LAS共培养基中暗培养3d。然后,将叶片转入MS+1.5mg/LTDZ+0.4 mg/L IBA+20 mg/L Km+250 mg/L Carb中进行筛选分化培养,出芽后转入1/2MS+0.2 mg/L IBA+5 mg/L Km+100 mg/L Carb中进行生根培养。3.利用优化后的草莓叶片转化体系,将YHeml基因导入外植体,共获得6个抗性株系,抗性芽诱导率为0.4%。经GUS、PCR、Southern杂交和RT-PCR检测显示,其中3株为转基因株系。内源ALA含量测定表明,转基因植株可以过量合成ALA,其内源ALA含量比野生型植株高出1倍多。4.比较转基因植株与野生型在28℃常温、45℃高温胁迫以及胁迫后恢复期草莓叶片快速叶绿素荧光特性的结果表明,转基因植株本身具有较高的叶绿素荧光特性,45℃高温胁迫0.5h后,最大光产额显著下降,常温恢复12h后,荧光产额均可恢复,但转基因植株仍然高于野生型。OJIP分析表明,转基因草莓叶片光合性能指数(PIABS)和电子传递到QA-下游的其他电子受体的概率(ψo)单位受光面积电子传递能量(ETo/CS)显著高于野生型,K相可变荧光占J相可变荧光的比例(Wk)和QA被还原的最大速率(Mo)低于野生型,暗示着YHeml基因转入可以提高草莓叶片抵抗高温胁迫的能力。

全文目录

摘要 9-11ABSTRACT 11-13缩略语 13-15引言 15-17第一部分文献综述 17-35 1 氨基乙酰丙酸的研究现状 17-27 1.1 ALA的天然存在 17-18 1.2 ALA的生物合成途径 18-21 1.2.1 C_4途径(C_4 pathway) 18-19 1.2.2 C_5途径(C_5 pathway) 19-21 1.3 ALAS的基因工程研究 21-22 1.4 ALA基因工程领域研究的新进展一转基因植物 22 1.5 ALA的生理作用 22-24 1.5.1 促进光合作用 22-23 1.5.2 影响呼吸作用 23 1.5.3 促进植物组织分化 23 1.5.4 启动细胞过氧化反应 23-24 1.6 ALA在农业中的潜在应用 24-27 1.6.1 农田除草剂 24-25 1.6.2 诱导植物组织再生 25 1.6.3 促进种子萌发 25 1.6.4 促进作物生长并提高产量 25-26 1.6.5 提高植物抗逆性 26 1.6.6 促进苹果着色 26-27 2 草莓叶片再生体系研究进展 27-30 2.1 基因型 27 2.2 基本培养基的影响 27-28 2.3 叶片发育程度及叶龄 28 2.4 培养条件 28-29 2.5 植物生长调节剂 29-30 2.6 添加物(AgNO_3) 30 3 草莓遗传转化体系研究进展 30-34 3.1 根癌农杆菌介导草莓遗传转化的影响因素 30-32 3.1.1 基因型 30-31 3.1.2 农杆菌菌株浸染力 31 3.1.3 浸染浓度和浸染时间 31 3.1.4 共培养时间 31 3.1.5 抗生素 31-32 3.1.6 乙酰丁香酮 32 3.2 草莓抗逆性遗传转化研究进展 32 3.3 草莓抗病虫害遗传转化研究进展 32-33 3.4 草莓抗除草剂遗传转化研究进展 33 3.5 改善草莓品质转基因研究 33-34 3.6 草莓耐贮运转基因研究 34 4 本试验研究目的与意义 34-35第二部分研究报告 35-69 第一章红颊草莓叶片不定芽再生的研究 35-43 1 材料与方法 36-37 1.1 试验材料 36 1.2 植物生长调节物质配制 36 1.3 不定芽诱导试验设计 36-37 1.3.1 植物生长调节物质组合 36 1.3.2 暗培养时间 36-37 1.3.3 不同叶位 37 1.3.4 叶龄的选择 37 1.3.5 AgNO_3对不定芽诱导的影响 37 1.4 不定芽生根 37 1.5 数据统计 37 2 结果与分析 37-40 2.1 不同浓度植物生长调节物质组合对叶片不定芽再生的影响 37-38 2.2 暗培养时间对叶片不定芽再生的影响 38-39 2.3 不同叶位叶片对不定芽再生的影响 39 2.4 不同叶龄对叶片不定芽再生的影响 39 2.5 AgNO_3对不定芽诱导的影响 39-40 2.6 生根 40 3 讨论 40-43 3.1 基因型 40 3.2 植物生长调节物质 40-41 3.3 叶龄及发育程度 41 3.4 叶位 41 3.5 暗培养条件 41 3.6 添加物AgNO_3 41-43 第二章红颊草莓遗传转化体系的建立 43-49 1 材料和方法 44-46 1.1 材料 44-45 1.1.1 植物材料 44 1.1.2 生化试剂和激素 44 1.1.3 培养条件 44 1.1.4 各种培养基 44-45 1.1.5 供试菌株及保存 45 1.1.6 载体构建 45 1.2 方法 45-46 1.2.1 浸染时间对转化效率的影响 45-46 1.2.2 Km对叶片不定芽再生的影响 46 1.2.3 AS对叶片不定芽再生的影响 46 1.3 遗传转化方法 46 2 结果分析 46-48 2.1 浸染时间的确定 46-47 2.2 卡那霉素(Km)浓度的确定 47 2.3 乙酰丁香酮(AS)对转化效果的影响 47-48 3 讨论 48-49 第三章抗KM草莓幼苗的分子检测 49-61 1 材料和方法 50-56 1.1 材料 50 1.2 方法 50-56 1.2.1 GUS组织化学染色 50 1.2.2 过量ALA和酶基因转化株系PCR检测 50-51 1.2.3 地高辛Southern检测 51-54 1.2.4 转ALA合酶基因草莓株系RT-PCR检测 54-55 1.2.5 ALA合酶(ALAS)活性测定 55 1.2.6 ALA含量测定 55-56 1.2.7 蛋白质含量测定 56 2 结果与分析 56-59 2.1 抗性‘红颊’草莓芽的获得及GUS组织染色检测 56 2.2 抗性‘红颊’草莓植株的PCR检测 56-57 2.3 抗性‘红颊’草莓植株的Southern杂交分析 57 2.4 抗性‘红颊’草莓植株的RT-PCR检测 57-58 2.5 转基因草莓株系ALA合酶活性和内源ALA含量 58-59 2.6 试管苗的生根与移栽 59 3 讨论 59-61 第四章过量合成ALA转基因草莓叶片快速叶绿素荧光特性对高温胁迫的响应 61-69 1 材料与方法 62-63 1.1 试验材料 62 1.2 试验方法 62-63 1.3 JIP-test分析 63 1.4 数据统计分析 63 2 结果与分析 63-67 2.1 不同株系草莓叶片叶绿素相对含量的影响 63 2.2 转基因草莓叶片快速叶绿素荧光诱导动力学分析 63-64 2.3 高温胁迫对转YHem1基因草莓叶片Fv/Fm和PI_(ABS)的影响 64-65 2.4 高温胁迫对转YHem1基因草莓叶片Mo、Wk和ψo的影响 65-66 2.5 高温胁迫对转基因草莓叶片ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS和DIo/CS 66-67 3 讨论 67-69全文结论 69-71主要创新点 71-73参考文献 73-85附录 85-89在读期间发表学术论文 89-91致谢 91

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