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鸡爪槭叶片花色素苷合成关键基因的克隆及序列分析

作　者: 安龙杰
导　师: 史宝胜
学　校: 河北农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 血红鸡爪槭 总RNA RT-PCR 基因克隆 序列分析
分类号: S687
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


鸡爪槭(Acer palmatum‘Bloodgood’)是槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)的多年生木本植物,具有丰富多彩的独特叶色,是一种重要的观叶植物,在园林绿化中广泛应用,备受关注。目前人们对血红鸡爪槭叶色形成的分子机理的研究相当缺乏,未见其叶色形成相关基因的克隆和序列分析的相关报道。这极大的限制了以血红鸡爪槭为代表的彩叶植物的分子育种和叶色基因工程的开展。花色素苷对彩叶植物叶色多彩的形成起主要作用,本研究从血红鸡爪槭叶片中克隆了花色素苷生物合成的几个关键基因,并对基因序列进行分析,以便探讨对血红鸡爪槭叶片花色素苷生物合成途径的分子调控机理,主要结果如下:1.采用柱式植物RNAout法、TRIZOL法和改良CTAB法三种提取方法对红枫叶片总RNA提取效果进行比较分析,以获得高质量的鸡爪槭叶片总RNA,结果表明:改良CTAB法更适于鸡爪槭叶片总RNA提取。2.采用RT-PCR和RACE-PCR的方法,成功获得了调控花色素苷表达的转录因子WD40基因,该基因全长1104bp,编码337个氨基酸,氨基酸C端含有4个WD重复基序。在NCBI中BLAST,发现获得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他物种的结构基因有较高的同源性,并且推断该基因为血红鸡爪槭的WD40转录因子。该基因已在Genbank中注册,注册号为JQ796698。3.采用RT-PCR方法,成功分离到CHS基因,该基因全长1466bp,编码438个氨基酸, NCBI中BLAST发现,所获得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他物种的结构基因CHS有较高的同源性,并且与毛果槭有相同的必须活性位点,推断该基因为血红鸡爪槭的CHS结构基因。该基因已在Genbank上注册,注册号为JQ796699。4.以基因组DNA为模版,克隆了F3H基因,该基因长度为2237bp,含有2个内含子,编码285个氨基酸,并且包含五个2-ODD蛋白的保守基序。NCBI中进行BLAST,所获得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他物种的结构基因F3H有较高的同源性,从而推断该基因为血红鸡爪槭的F3H结构基因, Genbank上的注册号为JX070083。5.以基因组DNA为模版,克隆得到ANS基因片段,该基因长度为448bp。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-20
  1.1 彩叶植物的概述  9-10
    1.1.1 彩叶植物的概念及分类  9-10
    1.1.2 彩叶植物的应用  10
  1.2 彩叶植物的呈色机理  10-12
    1.2.1 叶片呈色的基因控制  10-11
    1.2.2 嵌合体变异与叶片呈色  11
    1.2.3 外界环境因子对彩叶形成的影响  11-12
  1.3 花色素苷的研究进展  12-18
    1.3.1 花色素苷的结构与理化性质  13-14
    1.3.2 花色素苷的生物合成途径  14-15
    1.3.3 花色素苷的生物合成中的结构基因  15-17
    1.3.4 花色素苷的生物合成中的转录因子  17-18
  1.4 叶色的基因工程改良展望  18-19
  1.5 本研究目的意义  19-20
2 材料与方法  20-33
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 试验材料  20
    2.1.2 酶与生化试剂  20
    2.1.3 培养基与相关溶液的配制  20-21
    2.1.4 主要设备  21-22
    2.1.5 相关引物的合成  22
  2.2 方法  22-33
    2.2.1 总RNA 的提取  22-23
    2.2.2 反转录合成CDNA 第一条链  23-24
    2.2.3 血红鸡爪槭叶片基因组DNA 的提取  24
    2.2.4 WD40 转录因子的RT-PCR 反应体系的建立  24-25
    2.2.5 琼脂糖电泳检验  25-26
    2.2.6 CHS 结构基因的RT-PCR 反应体系的建立  26-27
    2.2.7 F3H 结构基因的PCR 反应体系的建立  27-28
    2.2.8 ANS 结构基因的PCR 反应体系的建立  28
    2.2.9 目的基因回收  28-29
    2.2.10 目的基因的连接  29
    2.2.11 大肠杆菌感受态的制备  29-30
    2.2.12 转化大肠感受态DH5α  30
    2.2.13 质粒DNA 的小量抽提  30-31
    2.2.14 阳性克隆的筛选与鉴定  31
    2.2.15 基因的测序与分析  31
    2.2.16 核酸序列分析  31-33
3 结果与分析  33-50
  3.1 血红鸡爪槭叶片总RNA 的质量与产率  33-35
  3.2 血红鸡爪槭叶片基因组DNA 提取  35
  3.3 血红鸡爪槭叶片WD40 基因的分离  35-39
    3.3.1 测序结果与序列分析  36-37
    3.3.2 血红鸡爪槭WD40 转录因子结构预测  37-38
    3.3.3 血红鸡爪槭WD40 氨基酸序列的系统进化树分析  38-39
  3.4 血红鸡爪槭叶片CHS 结构基因的分离  39-44
    3.4.1 中间片段的PCR 扩增  39
    3.4.2 上游片段的PCR 扩增  39-40
    3.4.3 下游片段的PCR 扩增  40
    3.4.4 测序结果与序列分析  40-43
    3.4.5 血红鸡爪槭CHS 氨基酸序列的系统进化树分析  43
    3.4.6 血红鸡爪槭CHS 基因三级结构预测  43-44
  3.5 血红鸡爪槭叶片F3H 基因的分离  44-48
    3.5.1 上游片段的PCR 扩增  44-45
    3.5.2 下游片段的PCR 扩增  45
    3.5.3 测序结果与序列分析  45-47
    3.5.4 血红鸡爪槭F3H 氨基酸序列的系统进化树分析  47-48
  3.6 血红鸡爪槭叶片ANS 基因的分离  48-49
  3.7 ANS 基因测序结果  49-50
4 讨论  50-53
  4.1 多酚植物总RNA 提取方法  50
  4.2 同源基因的分离  50-51
  4.3 血红鸡爪槭叶片WD40、CHS、F3H 和ANS 基因与花色素苷合成的关系  51-52
  4.4 下一步研究计划  52-53
5 结论  53-54
参考文献  54-60
在读期间发表的学术论文  60-61
作者简介  61-62
致谢  62-63

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 观叶树木类
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