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陆地棉开花相关基因GhMADS22/23/29的克隆与功能验证

作　者: 张文香
导　师: 喻树迅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 陆地棉 开花 基因克隆 功能验证 启动子
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


为了为短季棉的培育提供优良、充足的基因资源，本论文的主要目的是克隆开花相关基因并对其功能进行分析。SQUA亚族基因一般都具有促进开花的功能，本实验根据拟南芥的此亚族基因AtAP1和AtFUL的核酸序列，Blast搜索棉花的EST数据库，获得的EST进行拼接，得到两条具有完整开放阅读框的序列。根据拼接结果设计引物，PCR扩增该基因，分别命名为GhMADS22和GhMADS23。序列比对和进化树分析发现GhMADS22属于FUL分支，GhMADS23属于AP1分支。通过Blast雷蒙德氏棉的基因组序列，获得GhMADS22和GhMADS23的基因组序列，cDNA序列与基因组序列的比对发现，二者在起始密码子和终止密码子之间的DNA序列都存在8个外显子和7个内含子。不同时期顶芽的表达模式分析表明二者随着顶芽的发育，表达量都逐渐升高，不同组织的表达模式分析表明GhMADS22在叶片、顶芽、苞片的表达量均较高，在胚珠、纤维中几乎不表达；GhMADS23在各个花器官和顶芽中的表达量均较高，而在胚珠和纤维中同样不表达。而且GhMADS22和GhMADS23都受GA的正调控。通过转基因实验对GhMADS22的功能进行研究，发现GhMADS22的过表达能够促进拟南芥抽薹，同时也使得植株和花器官的形态发生变异：无限生长花序转变为顶端花和单生花；苞片或雌蕊的基部形成次级花；一朵花形成两个雌蕊、七个花瓣和雄蕊，或者一朵花只有3个花瓣，却有8个雄蕊无规则的环绕着雌蕊，也有的不含有苞片。此外，GhMADS22的过表达还延迟了花器官的脱落，而且ABA处理会促进GhMADS22的表达。因此认为GhMADS22在促进棉花开花、抗逆、延迟衰老方面可能具有作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。SVP基因具有延长植物营养生长阶段从而推迟开花的功能，本实验通过上述同样的方法在陆地棉中棉所36中克隆了SVP的同源基因GhMADS29，Blast搜索比对表明GhMADS29与猕猴桃的SVP4基因相似度最高。根据克隆到的GhMADS29的cDNA序列，Blast搜索雷蒙德氏棉的基因组序列，cDNA与基因组序列的比对表明GhMADS29含有9个外显子、8个内含子。不同时期顶芽的荧光定量结果表明它在花芽分化起始期的花芽中表达量最高，且不同组织的荧光定量分析表明它在叶片和顶芽中表达量较高，因此推测GhMADS29的作用模式可能与拟南芥SVP基因相同，但是转基因实验表明，长日照下过表达GhMADS29的拟南芥的抽薹时间及莲座叶数量并没有发生明显变化，因此推测棉花中可能存在其它SVP的同源基因发挥相应功能。根据GhMADS29的基因组序列设计引物，克隆到ATG上游-19位开始的1316bp的启动子序列，通过启动子元件分析发现，所得到的序列具有启动子所特有的元件和一些光、温、激素调控元件，且瞬时表达和转基因实验的GUS染色都证明了序列具有活性。转基因拟南芥不同组织的GUS染色实验表明，该启动子序列在幼苗的根和叶以及表皮毛中都有较强的活性，在萼片、花瓣、雌蕊等花器官中同样活性较强，而在雄蕊中没有检测到GUS活性，在角果的果瓣中也能够检测到GUS活性，但是在种子中未检测到GUS活性。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-17
第一章 引言  17-30
  1.1 开花时间的生理学控制  17-21
    1.1.1 环境因子介绍  17-18
    1.1.2 感应环境信号的植物器官  18
    1.1.3 植物自身特点与开花的关系  18-19
    1.1.4 植物激素对开花的控制  19-20
    1.1.5 糖对植物开花的控制  20-21
    1.1.6 一氧化氮与开花时间的关系  21
  1.2 开花时间的遗传学控制  21-23
  1.3 开花时间的表观遗传控制  23-24
    1.3.1 DNA 甲基化与开花时间  23-24
    1.3.2 组蛋白修饰与开花时间  24
  1.4 控制开花时间的 MADS-box 基因  24-27
    1.4.1 促进开花的 MADS-box 基因  24-26
    1.4.2 抑制开花的 MADS-box 基因  26-27
  1.5 开花途径研究进展  27-28
    1.5.1 光周期途径  27
    1.5.2 春化途径  27-28
    1.5.3 自主途径  28
  1.6 棉花 MADS-box 基因研究进展  28-29
  1.7 短季棉早熟性研究进展  29
  1.8 研究目的与意义  29-30
第二章 SQUA 类基因 GhMADS22/23 的克隆与分析  30-58
  2.1 实验材料  30
    2.1.1 植物材料  30
    2.1.2 菌株与试剂  30
    2.1.3 主要仪器  30
  2.2 实验方法  30-44
    2.2.1 赤霉素处理  30
    2.2.2 脱落酸处理  30-31
    2.2.3 棉花总 RNA 的提取及反转录  31-34
    2.2.4 引物设计与基因克隆  34-35
    2.2.5 PCR 产物的序列确定  35-36
    2.2.6 实验中常用培养基和溶液配制  36-37
    2.2.7 质粒的提取  37
    2.2.8 序列分析  37-38
    2.2.9 荧光定量 PCR  38
    2.2.10 过表达载体的构建  38-39
    2.2.11 亚细胞定位载体的构建  39
    2.2.12 洋葱表皮的侵染  39-40
    2.2.13 诱导表达载体的构建  40-41
    2.2.14 农杆菌的转化  41-42
    2.2.15 浸花法拟南芥的遗传转化  42
    2.2.16 棉花的遗传转化  42-44
    2.2.17 转基因植株的表型分析  44
  2.3 结果与分析  44-56
    2.3.1 GhMADS22/23 EST 的获得与拼接  44-45
    2.3.2 棉花总 RNA 的提取  45
    2.3.3 GhMADS22/23 的 PCR 克隆  45-47
    2.3.4 GhMADS22/23 的序列分析  47-48
    2.3.5 GhMADS22/23 的表达模式  48-50
    2.3.6 GhMADS22/23 亚细胞定位  50-51
    2.3.7 过表达 GhMADS22 的转基因拟南芥的表型  51-53
    2.3.8 ABA 促进 GhMADS22 的表达  53-54
    2.3.9 转基因棉花的获得  54-55
    2.3.10 诱导表达载体的构建  55-56
  2.4 讨论  56-58
第三章 SVP 类基因 GhMADS29 的克隆与分析  58-70
  3.1 实验材料  58
    3.1.1 植物材料  58
    3.1.2 菌株与试剂  58
    3.1.3 主要仪器  58
  3.2 实验方法  58-63
    3.2.1 取样  58
    3.2.2 棉花总 RNA 的提取及反转录  58-59
    3.2.3 引物设计与基因克隆  59
    3.2.4 序列分析  59-60
    3.2.5 荧光定量 PCR  60
    3.2.6 过表达载体的构建  60-61
    3.2.7 植物诱导表达载体的构建  61
    3.2.8 拟南芥的遗传转化  61
    3.2.9 棉花的遗传转化  61
    3.2.10 阳性转基因植株的鉴定  61-62
    3.2.11 转基因拟南芥的表型分析  62-63
  3.3 结果与分析  63-68
    3.3.1 GhMADS29 基因的获得  63
    3.3.2 GhMADS29 的序列分析  63-66
    3.3.3 GhMADS29 的表达模式  66-67
    3.3.4 35S::GhMADS29 过表达载体转野生型拟南芥的表型分析  67
    3.3.5 转基因棉花植株的获得  67-68
  3.4 讨论  68-70
第四章 GhMADS29 启动子的克隆与分析  70-80
  4.1 实验材料  70-71
    4.1.1 植物材料  70
    4.1.2 菌株与试剂  70
    4.1.3 主要仪器  70-71
  4.2 实验方法  71-74
    4.2.1 棉花基因组 DNA 的提取  71-73
    4.2.2 GhMADS29 启动子的克隆  73
    4.2.3 GhMADS29 启动子序列的生物信息学分析  73
    4.2.4 GhMADS29 启动子与 GUS 植物融合载体的构建  73
    4.2.5 洋葱表皮瞬时表达  73
    4.2.6 拟南芥的遗传转化  73-74
    4.2.7 GUS 组织化学染色  74
  4.3 结果与分析  74-79
    4.3.1 GhMADS29 启动子的获得  74-75
    4.3.2 GhMADS29 启动子序列分析  75
    4.3.3 启动子植物表达载体的构建  75
    4.3.4 瞬时表达启动子活性分析  75-78
    4.3.5 启动子组织特异性分析  78-79
  4.4 讨论  79-80
第五章 全文结论  80-81
  5.1 全文结论  80
  5.2 研究展望  80-81
参考文献  81-91
致谢  91-92
作者简历  92

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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