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苜蓿花药培养与雄性不育差异表达分析

作　者: 高霞
导　师: 石凤翎
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 苜蓿雄性不育系花药组织培养单倍体流式细胞术 cDNA-AFLP
分类号: S541.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为了解雄性不育形成的分子机理,获得苜蓿雄性不育纯合系植株,进一步提高苜蓿雄性不育杂种优势的利用价值,本试验以苜蓿雄性不育株及其对应可育株的花蕾作为研究对象,通过花药组织培养技术获得苜蓿单倍体植株,同时利用cDNA.AFLP差异显示技术对不同发育时期不育株和可育株花蕾的基因差异表达进行研究,探讨了苜蓿雄性不育性的基因差异表达模式,并进一步对差异基因片段进行氨基酸序列和蛋白质结构的分析。主要研究结果如下：(1)苜蓿雄性不育株与可育株花药组织培养的研究表明,在现蕾初期取材、不经低温处理的花药愈伤组织诱导率可高达66.7%,且培养条件为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L+NAA0.2mg/L+KT3mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂：适宜不育材料的分化培养基为MS+KT1mg/L+NAA0.2mg/L+2%蔗糖+0.7%琼脂,适宜可育材料的为MS+KT4mg/L+NAA0.2mg/L+2%蔗糖+0.7%琼脂；适合诱导幼苗生根的培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+2%蔗糖+0.9%琼脂；此外,不添加激素的MS培养基可以诱导玻璃化苗生根。(2)在苜蓿花药组织培养再生植株的倍性鉴定研究中,适宜的细胞核悬液制备方法是选择新鲜幼苗叶片,在0.1mol/L柠檬酸和0.2%TritonX.100组成的分离缓冲液中用刀片进行机械切割,经两步离心法(800rpm离心5min)分离；同时,利用100～200μL浓度为50mg/L的PI染液对材料细胞核染色效果好；通过流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定,结果获得单倍体、四倍体和混倍体的比例分别为：16%、78%和6%。(3)对苜蓿不育株与可育株花蕾的cDNA.AFLP技术体系进行优化,发现该技术重复性高、多态性好,适用于苜蓿不同时期花蕾基因差异表达的研究。通过12对引物获得1746条能够稳定存在的条带,其中差异表达基因占12.37%,且包括不育性特异表达、不育性表达和育性特异表达3种类型。(4)将4条苜蓿花蕾期的基因差异片段进行cDNA序列分析。通过NCBI中BlastN和BlastX数据库检索,结果发现3条片段与苜蓿具有较高同源性(93%～100%)。其中,3号差异片段与蚕豆叶绿体中的1,5-二磷酸核酮糖羧化基因和氧化酶大亚基基因的同源性高达98～99%,而二磷酸核酮塘羧化酶与植物的CMS有关,参与了小麦花药发育调控、细胞程序性死亡及物质能量代谢等过程,因此推测该差异片段与苜蓿雄性不育性的形成有关。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-13
1 引言  13-33
  1.1 植物雄性不育研究现状  13-16
    1.1.1 植物雄性不育类型  13-14
    1.1.2 植物雄性不育经典遗传学研究进展  14-15
    1.1.3 植物雄性不育细胞生物学研究进展  15
    1.1.4 植物雄性不育分子生物学研究进展  15-16
  1.2 生物技术在植物雄性不育系上的应用  16-28
    1.2.1 组织培养技术在植物育种中的应用  16-17
    1.2.2 基因工程技术在植物育种中的应用  17
    1.2.3 花药培养单倍体育种技术  17-23
    1.2.4 植物雄性不育基因分子生物学研究  23-28
  1.3 国内外苜蓿雄性不育系研究现状  28-30
    1.3.1 国外苜蓿雄性不育系研究现状  28-29
    1.3.2 国内苜蓿雄性不育系研究现状  29-30
  1.4 研究目的意义  30-31
  1.5 研究主要内容  31-32
  1.6 技术路线图  32-33
2 苜蓿花药培养的研究  33-49
  2.1 试验材料  33
  2.2 试验方法  33-38
    2.2.1 材料预处理  33-34
    2.2.2 花药愈伤组织诱导培养条件的试验设计  34-35
    2.2.3 花药愈伤组织分化培养条件的试验设计  35-36
    2.2.4 花药植株生根培养条件的试验设计  36
    2.2.5 花药再生植株移栽成活条件的试验设计  36-37
    2.2.6 评价方法和指标  37-38
  2.3 结果与分析  38-45
    2.3.1 愈伤组织诱导培养条件的筛选  38-41
    2.3.2 愈伤组织分化培养条件的筛选  41-43
    2.3.3 再生植株生根诱导培养条件的筛选  43-45
    2.3.4 花药再生植株移栽成活情况  45
  2.4 讨论  45-48
    2.4.1 基本培养基对苜蓿花药培养的影响  45-46
    2.4.2 植物激素对苜蓿花药培养的影响  46
    2.4.3 取材时期的选择对苜蓿雄性不育株花药愈伤形成的影响  46-47
    2.4.4 低温对苜蓿雄性不育株花药愈伤形成的影响  47
    2.4.5 愈伤组织形态对分化能力的影响  47
    2.4.6 玻璃苗成因及防治措施  47-48
    2.4.7 不育材料与可育材料在花药培养中的差异  48
  2.5 结论  48-49
3 苜蓿花药培养再生植株的倍性鉴定  49-62
  3.1 试验材料  49
  3.2 试验方法  49-52
    3.2.1 试验仪器及药品  49-50
    3.2.2 试验样品预处理  50-51
    3.2.3 上机测定  51-52
  3.3 结果与分析  52-57
    3.3.1 离心方法对细胞核悬液DNA分辨率的影响  52
    3.3.2 离心转速对细胞核悬液DNA分辨率的影响  52-53
    3.3.3 材料破碎方法对细胞核悬液DNA分辨率的影响  53-54
    3.3.4 不同分离缓冲液对细胞核悬液DNA分辨率的比较  54-55
    3.3.5 PI染液和RNA酶A浓度对细胞核悬液DNA分辨率的影响  55-56
    3.3.6 低温保存苜蓿花药培养再生植株叶片对倍性检测的影响  56
    3.3.7 苜蓿花药组培再生植株的倍性检测结果分析  56-57
  3.4 讨论  57-61
    3.4.1 细胞核悬液的质量对流式细胞仪测定的影响  58-60
    3.4.2 DNA荧光染色对流式细胞仪测定的影响  60
    3.4.3 参照样本的选择对流式细胞仪测定结果的影响  60-61
    3.4.4 流式细胞仪测定苜蓿花药培养再生植株倍性的可行性  61
  3.5 结论  61-62
4 苜蓿雄性不育株及其可育株的CD、N-AFLP差异显示分析  62-89
  4.1 试验材料  62-63
  4.2 试验方法  63-74
    4.2.1 总RNA的提取  63-64
    4.2.2 RNA浓度和质量的检测  64-65
    4.2.3 双链cDNA的合成  65-67
    4.2.4 双链cDNA的电泳检测  67
    4.2.5 cDNA-AFLP分析  67-71
    4.2.6 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  71-72
    4.2.7 数据统计及分析  72-73
    4.2.8 水煮法回收差异片段  73
    4.2.9 差异片段的再扩增  73
    4.2.10 再扩增产物的纯化回收  73-74
    4.2.11 差异片段的测序与分析  74
  4.3 结果分析  74-85
    4.3.1 总RNA质量和浓度检测结果分析  74
    4.3.2 保存时间对RNA质量的影响  74-75
    4.3.3 cDNA的合成结果分析  75
    4.3.4 双酶切和连接产物结果分析  75-76
    4.3.5 预扩增体系筛选及优化  76-78
    4.3.6 选择性扩增体系分析  78-79
    4.3.7 差异表达基因片段模式  79
    4.3.8 苜蓿cDNA-AFLP的基因差异表达分析  79-80
    4.3.9 差异表达基因片段的回收与测序  80-81
    4.3.10 差异表达基因片段序列分析  81-83
    4.3.11 差异表达基因片段的同源性分析  83
    4.3.12 差异表达基因片段亲疏水性及跨膜结构的分析  83-84
    4.3.13 差异表达基因片段的二级结构预测  84
    4.3.14 差异表达基因片段的亚细胞定位  84-85
  4.4 讨论  85-89
    4.4.1 RNA提取及cDNA合成中的影响因素  85-86
    4.4.2 cDNA-AFLP技术体系优化  86
    4.4.3 多态性差异片段的表达  86-87
    4.4.4 差异片段的回收、测序及功能预测  87
    4.4.5 差异表达基因片段的序列及蛋白质结构分析  87-88
    4.4.6 苜蓿雄性不育性形成机理初探  88-89
  4.5 结论  89
5 下一步研究展望  89-90
致谢  90-91
参考文献  91-113
附录  113-139
作者简介  139

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