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大麦坚黑粉菌遗传转化体系优化及其侵染机制初探

作　者: 张新明
导　师: 朱睦元
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 大麦坚黑粉菌遗传转化 ATMT方法单倍体孢子配对侵染大麦
分类号: S435.123
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)是一类引起大麦产生黑粉状病穗的真菌,严重危害全球的大麦生产。本论文研究了大麦坚黑粉菌的生理特性及其侵染机制,建立了大麦坚黑粉菌的遗传转化体系,并对转化相关因子作了优化,获得了如下主要结果：1.用两个真菌基因表达启动子gpdA和hsp70分别替换质粒pCAMBIA1301中的35S启动子,构建了真菌表达载体3×pgpdA-1301和3×phsp70-1301。然后进一步引入GFP报告基因,获得了载体3×pgpdA-1301-GFP和3×phsp70-1301-GFP。这四个载体均可用于大麦坚黑粉菌的遗传转化,其转化子可通过载体上的潮霉素抗性基因或GFP进行筛选。2.通过对影响大麦坚黑粉菌生长状态条件因子如培养温度、培养基pH和培养基组成等的分析和优化,确定了适合于大麦坚黑粉菌生长的较佳条件：温度23℃,pH7.0。培养基组成对黑粉菌生长影响较小,低浓度碳源、氮源即可满足生长,且盐离子对生长影响较小。3.比较了PEG-CaCl2法、电击法和农杆菌介导(ATMT)法对大麦坚黑粉菌的转化效率,明确ATMT法显著优于其他两种方法。然后在ATMT方法基础上,对影响其遗传转化效率的主要因子进行了优化,得到优化条件为：AS浓度200-400 mM,预培养时间12-18h,共培养时间48-72h。4.通过观察大麦坚黑粉菌体外配对、侵染拟南芥和大麦等寄主的过程,初步明确了其侵染机制及对寄主产生的影响。大麦坚黑粉菌同玉米黑粉菌一样,其双倍体菌丝的形成过程是：首先由单倍体在一端产生结合管后,然后在对方信息素的引导下使结合管延伸,最终结合并由结合处长出双倍体菌丝。大麦坚黑粉菌的侵染会对寄主根的分生区和物质运输通道——中柱造成“损伤”,从而抑制寄主根的生长,但同时却会促进其根毛的发育。

全文目录

摘要  9-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-29
  1 黑粉菌的分类学地位及生理特征  12-13
  2 黑粉菌的侵染致病机理  13-15
  3 黑粉菌与寄主植株的互作  15-16
  4 黑粉菌的药用和食用价值  16-18
    4.1 药用价值  16-17
    4.2 食用价值  17-18
  5 黑粉菌的研究进展  18-26
    5.1 作为研究病原性真菌致病机理的模式真菌  18-21
    5.2 作为研究动物细胞生理机制的模式真菌  21-26
      5.2.1 DNA修复机制  22-23
      5.2.2 远距离运输机制  23-24
      5.2.3 微管蛋白组织机制  24-25
      5.2.4 有丝分裂机制  25-26
  6 研究目的和意义  26-29
第二章真菌表达载体的构建  29-42
  1 材料和方法  29-35
    1.1 材料  29-30
    1.2 方法  30-35
      1.2.1 启动子及报告基因的PCR扩增  30-33
      1.2.2 T-A克隆并测序  33-34
      1.2.3 感受态细胞的制备  34
      1.2.4 大肠杆菌的转化  34
      1.2.5 质粒的小提  34
      1.2.6 农杆菌的转化  34-35
  2 结果与分析  35-40
    2.1 载体构建流程图  35-36
    2.2 PCR扩增gpdA启动子  36
    2.3 pgpdA-pMD19-T载体的构建和验证  36-37
    2.4 真菌表达载体的构建  37-39
    2.5 重组载体的农杆菌转化和筛选  39-40
  3 讨论  40-42
第三章大麦坚黑粉菌生理特性研究  42-48
  1 材料和方法  42-44
    1.1 材料  42
    1.2 方法  42-44
      1.2.1 大麦坚黑粉菌菌落和细胞形态的观察  42-43
      1.2.2 最佳生长温度的测定  43
      1.2.3 最佳PH值的测定  43
      1.2.4 最佳培养基组成的测定  43-44
      1.2.5 实验重复性  44
  2 结果与分析  44-46
    2.1 大麦坚黑粉菌的菌落和细胞形态  44-45
    2.2 大麦坚黑粉菌的最佳生长温度  45
    2.3 大麦坚黑粉菌生长的最佳pH值  45-46
    2.4 不同培养基对大麦坚黑粉菌生长的影响  46
  3 讨论  46-48
第四章大麦坚黑粉菌遗传转化体系优化  48-62
  1 材料和方法  48-53
    1.1 材料  48-49
    1.2 方法  49-53
      1.2.1 筛选培养基抗生素浓度的确定  49
      1.2.2 PEG-CaCl_2法转化黑粉菌  49-50
      1.2.3 电击法转化黑粉菌  50-51
      1.2.4 农杆菌介导的ATMT法转化黑粉菌  51-52
      1.2.5 影响农杆菌介导(ATMT)法转化黑粉菌效率的因素  52
      1.2.6 转化子稳定性检测  52
      1.2.7 转化子基因组的提取  52
      1.2.8 Southern杂交  52-53
  2 结果与分析  53-59
    2.1 筛选培养基抗生素浓度的确定  53
    2.2 三种转化方法的转化效率比较  53-54
    2.3 农杆菌介导的ATMT法的参数优化  54-57
      2.3.1 农杆菌在AS中预培养对转化效率的影响  54-55
      2.3.2 农杆菌数目对大麦坚黑粉菌转化效率的影响  55-56
      2.3.3 共培养时间对转化效率的影响  56-57
    2.4 转化子稳定性的检测  57
    2.5 转化子的鉴定  57-59
      2.5.1 转化子基因组的提取  57-58
      2.5.2 转化子的PCR鉴定  58-59
      2.5.3 转化子拷贝数的检测  59
  3 讨论  59-62
    3.1 ATMT法在大麦坚黑粉菌转化中优于其他遗传转化方法  59-60
    3.2 影响ATMT法转化效率的主要因子优化  60-61
    3.3 转化子的PCR鉴定及拷贝数验证  61-62
第五章大麦坚黑粉菌侵染寄主  62-74
  1 材料和方法  62-64
    1.1 材料  62
    1.2 方法  62-64
      1.2.1 单倍体菌株的体外配对结合  62-63
      1.2.2 大麦种子发芽培养  63
      1.2.3 黑粉菌侵染大麦和拟南芥  63
      1.2.4 侵染寄主组织的染色观察  63-64
  2 结果与分析  64-71
    2.1 单倍体大麦坚黑粉菌的体外配对  64-66
    2.2 单倍体在植株表面的配对结合及体内侵染  66
    2.3 大麦坚黑粉菌侵染拟南芥  66-69
    2.4 大麦坚黑粉菌侵染大麦  69-71
  3 讨论  71-74
    3.1 大麦坚黑粉菌的配对机制  71-72
    3.2 大麦坚黑粉菌的侵染对拟南芥生理的影响  72-73
    3.3 大麦坚黑粉菌的侵染对寄主大麦生理的影响  73-74
致谢  74-75
参考文献  75-83
附录  83

大麦坚黑粉菌遗传转化体系优化及其侵染机制初探

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