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毒死蜱诱导西花蓟马差异蛋白分析及细胞色素P450CYP6基因克隆与发烟施药技术研究

作　者: 胡敏
导　师: 范加勤
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 西花蓟马 室内筛选 iTRAQ LC-MS/MS 差异蛋白 基因克隆 烟雾防治
分类号: S482.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 4次
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内容摘要


西花蓟马Frankliniella ocddentalis (Pergande)是世界上重要的农作物害虫和检疫对象,我国于2003年在北京首次发现。其体型小,隐匿性强,繁殖方式独特,抗药性发展迅速,为研究抗药性形成机制与有效防治带来了较大困难,本研究通过采用“药膜+浸叶”法,对西花蓟马进行室内抗性筛选,并利用iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术分析敏感品系西花蓟马与抗性品系的差异蛋白质组,选取其中差异表达蛋白编码基因细胞色素P450CYP6进行克隆与表达；并对热力发烟施药技术防治西花蓟马进行了相关研究,结果如下：1.采用“药膜+浸叶”法对西花蓟马室内群体进行抗毒死蜱筛选,测定西花蓟马对毒死蜱的敏感水平,利用毒死蜱LC75处理西花蓟马二龄若虫,在建成一定规模的群体后,再次生物测定重复上述过程,共处理19次,西花蓟马对毒死蜱的敏感性下降39倍。2.本研究以敏感品系的西花蓟马为对照组,分别收集敏感品系和抗性品系的西花蓟马各300头,提取蛋白,并进行iTRAQ标记和LC-MS/MS分析鉴定。共鉴定出773个蛋白质,其中的差异表达的蛋白为20个。差异蛋白主要有连接、催化、转运及酶调节等分子功能；主要参与了代谢、发育、生物调节、应激反应等生物过程；绝大部分蛋白质处于细胞、细胞器、高分子中,有极少部分存在于胞外区。这些差异蛋白还参与了各种通道途径,如代谢途径、次级代谢产物的生物合成、氧化磷酸化等。通过分析差异蛋白,参照NCBI相应序列,设计引物,克隆西花蓟马细胞色素P450CYP6基因,并进行外源表达。3.本研究选取不同配比的热雾剂,以不同的溶剂混合,并选用不同喷药方式测定了热力烟雾机对西花蓟马的室内防效。结果表明,烟雾防治效果要远远高于常规水雾防治效果,最高防治效果能达到95%。热雾剂以药液：溶剂：水为1：3：6比例配制时雾滴分布均匀,一个视野内数目多,利于扩散弥漫。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
上篇 文献综述  10-33
  第一章 西花蓟马  11-21
    1 西花蓟马的起源与分布  11-12
    2 西花蓟马的寄主范围与危害  12-13
    3 西花蓟马的形态特征与生物学特性  13-14
    4 西花蓟马的抗药性及其防治  14-17
    5 西花蓟马的烟雾防治  17-21
  第二章 差异蛋白质组学研究  21-27
    1 基本特征  21
    2 差异蛋白组学研究  21-23
    3 差异蛋白质组学的研究方法  23-26
      3.1 ICAT技术  23-24
      3.2 iTRAQ技术  24
      3.3 双向电泳  24-25
      3.4 SELDI蛋白质芯片技术  25-26
    4 差异蛋白研究的应用前景  26-27
  第三章 西花蓟马细胞色素P450基因克隆与外源表达  27-33
    1 细胞色素P450基因的结构与功能  27-28
    2 细胞色素P450基因与抗药性  28
    3 细胞色素P450基因的表达  28-33
      3.1 大肠杆菌表达系统  29-31
      3.2 酵母表达系统  31-32
      3.3 昆虫细胞表达系统  32-33
下篇 研究内容  33-68
  第一章 西花蓟马抗毒死蜱室内筛选  34-38
    摘要  34
    1 材料与方法  34-36
      1.1 供试虫源  34-35
      1.2 试剂与仪器  35
      1.3 西花蓟马的抗性筛选  35
      1.4 统计分析方法  35-36
    2 结果  36-37
      2.1 西花蓟马抗毒死蜱基线建立  36
      2.2 西花蓟马抗毒死蜱筛选  36-37
    3 讨论  37-38
  第二章 西花蓟马差异蛋白分析及细胞色素P450CYP6基因克隆  38-62
    摘要  38-39
    1 材料与方法  39-47
      1.1 供试虫源  39
      1.2 试剂与仪器  39
      1.3 蛋白提取  39
      1.4 蛋白定量  39-40
      1.5 SDS-PAGE电泳  40
      1.6 酶解及iTRAQ标记  40
      1.7 液相分离  40
      1.8 液相串联质谱分析  40-41
      1.9 DNA的提取  41
      1.10 引物设计  41-42
      1.11 PCR反应体系  42
      1.12 PCR反应程序  42
      1.13 PCR扩增产物电泳  42
      1.14 空质粒转化  42-43
      1.15 质粒提取  43
      1.16 质粒酶切体系  43-44
      1.17 质粒和DNA连接体系  44
      1.18 酶切和PCR验证  44
      1.19 酵母诱导表达  44-45
      1.20 大肠杆菌诱导表达  45-47
    2 结果  47-59
      2.1 蛋白定量及SDS-PAGE电泳  47
      2.2 全蛋白质鉴定及功能归类分析  47-54
      2.3 差异蛋白鉴定  54-55
      2.4 差异蛋白的功能归类分析  55-56
      2.5 PCR扩增产物电泳结果  56-57
      2.6 重组质粒酶切验证与PCR验证  57-58
      2.7 转化子筛选结果  58-59
      2.8 诱导表达  59
    3 讨论  59-62
  第三章 发烟施药技术研究  62-68
    摘要  62-63
    1 材料与方法  63-65
      1.1 供试虫源  63
      1.2 试剂与仪器  63
      1.3 烟雾实验药液配制  63
      1.4 水雾实验药液配制  63-64
      1.5 不同配比的热雾剂  64
      1.6 烟雾实验  64
      1.7 水雾实验  64-65
      1.8 数据统计方法  65
    2 结果与分析  65-66
      2.1 不同溶剂的热雾剂  65
      2.2 不同的喷雾方式  65
      2.3 不同配比的热雾剂  65-66
    3 讨论  66-68
全文小结  68-70
附录  70-74
参考文献  74-84
攻读硕士期间发表或待发表论文情况  84-86
致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 杀虫剂 > 有机磷类杀虫剂
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