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不同致病力柑橘衰退病毒株系诱导甜橙表达差异蛋白质组学研究

作　者: 杨方云
导　师: 周常勇; 李中安
学　校: 西南大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘衰退病差异表达蛋白质组学 DIGE 质谱 KEGG分析 GO分类核酸验证
分类号: S436.661.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病是柑橘上一种具有经济重要性的病害,可危害甜橙和柚等品种,广泛分布于世界各柑橘产区。CTV主要通过感病接穗、苗和蚜虫传播,仅用无病毒苗木和药物不能完全控制该病的流行,应用弱毒株系交叉保护技术可在某些柑橘品种上防御部分强株系的侵入。目前对于CTV的致病机理和弱毒株系交叉保护机理仍然不够清楚。蛋白质是生物体功能的执行单元,从蛋白组学方面深入探讨CTV致病机理具有重要意义。因此,结合不同致病力株系开展CTV诱导甜橙表达差异蛋白质组学研究,对于了解CTV与寄主柑橘的互作,CTV弱毒株系交叉保护机理,进而为后期开展柑橘衰退病抗病育种和弱毒株系研发起到很好的推动作用。本研究在柑橘病害实验室建立了甜橙叶蛋白质提取和双向凝胶电泳方法；利用普通双向电泳(2D-PAGE)、向荧光差异电泳(2D-DIGE)结合基质辅助激光解析二级质谱(MALDI-TOF/TOF MS/MS)的方法对CTV强毒株系TRL514和CT32、弱毒株系CT30和CT11A侵染甜橙叶片诱导表达的差异蛋白进行分离和鉴定；对差异蛋白表达量进行精确分析；利用KEGG数据库、Brite分类、Pathway通路和Module功能块、GO数据库检索,明确差异蛋白关联的细胞组分、分子功能和生物学进程信息；明确差异蛋白表达变化与CTV株系致病力的关系；采用RT-qPCR检测技术对来源于柑橘上的差异蛋白的相对表达量进行了初步验证。主要研究结果如下：1.甜橙叶蛋白双向凝胶电泳方法的建立通过SDS-PAGE比较了酚提取法、三氯醋酸-丙酮沉淀法、三氯醋酸-酚结合法提取甜橙叶总蛋白效果,结果表明三氯醋酸-酚结合法的提取效果最好。以三氯醋酸-酚结合法提取的甜橙叶总蛋白进行双向电泳,得出：一般7cm胶条上样5-10μL,最高电压8000V条件聚焦30-100kVhr能够较好分离蛋白；13cm胶条上样10-15μL,最高电压8000V条件聚焦80-150kVhrR能够较好分离蛋白。2.4个CTV株系诱导甜橙表达差异蛋白的2D分析利用2D PAGE技术对4个CTV株系(强株系TRL514(?)CT32,弱株系CT30和CT11A)在锦橙叶上诱导表达的差异蛋白进行了比较分析,结果表明CTV诱导表达的差异蛋白主要分布在pH4-7范围内,利用pH4-7范围的13cm胶条更适合分离到最大量的差异蛋白。3.CTV强弱株系诱导甜橙表达差异蛋白的2D-DIGE分析利用2D-DIGE电泳从CTV强毒株系、弱毒株系和健康对照3组样本共10例样品的5张凝胶上获得了15幅不同荧光蛋白图谱。应用DeCyder2DTM软件进行蛋白图谱的胶内差异分析和凝胶间比较分析,在每块凝胶上获得超过3000个蛋白质点的信息。三组间one-way分析(0≤p≤0.001)结果显示存在82个显著表达差异蛋白,3Dgraph作图直观展示出差异蛋白在3组样本中的相对表达量高低。以p<0.05进行两组间差异蛋白t-test检验分析,在相对表达量差异1.2倍和1.5倍水平上,分别发现强毒株系与弱毒株系间存在差异表达蛋白点84个和32个,其中强毒株系相对于弱毒株系上调表达蛋白点分别为40个和10个,下调表达蛋白点分别为44个和22个。采用相同方式在1.2倍和1.5倍水平上,分别发现强毒株系与健康对照间的差异蛋白点139个和91个,其中强毒株系相对于对照上调蛋白点81个和56个,下调蛋白点58个和35个；分别发现弱毒株系与健康对照间的差异蛋白点116个和84个,其中弱毒株系相对于对照上调蛋白点79个和57个,下调蛋白点37个和27个。与健康对照比较,CTV强毒株系和弱毒株系样本中上调的差异蛋白点数均多于下调的差异蛋白点数。结果显示,CTV侵染诱导了甜橙更多蛋白的增量表达。4.CTV诱导甜橙表达差异蛋白的质谱鉴定与功能分析利用二级质谱分析和Mascot软件搜索,成功对123个差异蛋白点进行鉴定,共获得非重复蛋白质76个。其中,偏酸性蛋白点有82个,偏碱性蛋白点有41个,酸性蛋白点的等电点均在pH4-7的范围内,碱性蛋白点的等电点大部分在pH8-9的范围内：所鉴定蛋白质分子量绝大部分位于10kDa-55kDa之间。利用KEGG工具对76个差异蛋白进行数据库搜索,表明54个差异蛋白质分属于27种KO分类号蛋白类型,22个差异蛋白质没有匹配的KO分类号。27种差异蛋白类型可按8种方式进行归类,其中超过20种属于同源功能蛋白类和酶类,显示出衰退病诱导表达的差异蛋白与多种生物学反应相关。其中6种属于光合作用蛋白类,各有1-2种差异蛋白类型属于肽酶类、蛋白酶体类、分子伴侣和折叠催化酶类、异戊烯基转移酶类或翻译因子类。同源功能蛋白涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和人类疾病5个方面。通路功能聚类分析表明,组织中普遍含量较高的碳水化合物和能量代谢途径中找到了较多差异蛋白,神经组织退化疾病与折叠、分选和降解通路中也发现了较多差异蛋白。参与蛋白折叠、分选和降解通路的热激蛋白和蛋白酶体一般都与寄主抗病毒感染或病毒造成寄主致病的机制相关联,推测几种相关差异蛋白类型K13993、K02730、K02732、K01689、K00134和K04565有可能与衰退病诱导甜橙表达差异蛋白的关系密切。特别发现了10种差异蛋白可能具有与衰退病侵染更为密切或某种特别的关系,它们是：3-磷酸甘油醛脱氢酶,在胞外域和共质体中有表达,影响了生物调控和定位进程,直接参与了疾病通路,可反映出衰退病与甜橙互作中信号传递与致病机制的某些信息；Cu/Zn超氧化物歧化酶,在胞外域中有表达,影响了生物调控进程,直接参与了疾病通路,可反映衰退病与甜橙的互作关系；HSP20家族热激蛋白和烯醇化酶,参与了遗传信息处理通路,可能反映衰退病毒通过干扰甜橙基础遗传信息加工、传递等实现对寄主多方面生物性状的影响；20S蛋白酶体α1亚基和β6亚基,在大分子复合物或胞外域中有表达,参与了两种免疫蛋白酶体功能块,影响了死亡进程、信号发送与免疫系统过程,可反映衰退病的致病机制信息和体现衰退病侵染后甜橙的免疫反应状况；异柠檬酸脱氢酶和I类果糖二磷酸醛缩酶,在胞外域或共质体中有表达,影响了生物调控或定位进程,参与了较多的通路和功能块,可反映出衰退病与甜橙互作中信号传递与致病机制的某些信息；F型氢离子运送ATP酶β亚基,在大分子复合物中有表达,影响定位进程,参与较多通路和功能块,是唯一具有转运子活性的差异蛋白,可能在衰退病影响甜橙反应中具有比较特别的功能作用；硫氧还蛋白H型5,是所有差异蛋白中唯一表现具有电子载体活性的蛋白质,值得关注是否在衰退病影响甜橙反应中具有某种特别的作用。5.CTV强弱株系诱导甜橙表达差异蛋白的比较分析鉴定到的123个差异蛋白中,匹配到强株系TRL514与健康对照Control(?)的差异点97个,其中61个上调；匹配到弱株系CT11A与健康对照Controll司的差异点89个,其中61个上调；匹配到强株系TRL514与弱株系CT11A间的差异点51个,其中24个上调。对10种比较重要的蛋白类型进行比较,匹配到差异蛋白点14个,CTV强弱株系侵染均诱导上调表达的差异蛋白为3-磷酸甘油醛脱氢酶、20S蛋白酶体α1亚基、20S蛋白酶体β6亚基、F型氢离子运送ATP酶β亚基、Cu/Zn超氧化物歧化酶和硫氧还蛋白H型5；CTV强弱株系侵染均诱导下调表达的蛋白为HSP20家族热激蛋白、I类果糖二磷酸醛缩酶和异柠檬酸脱氢酶。6.CTV诱导差异蛋白表达的RT-qPCR检测利用RT-qPCR方法,成功对差异蛋白NADP-异柠檬酸脱氢酶的相对表达进行验证。结果表明,衰退病强株系侵染时甜橙的JADP-异柠檬酸脱氢酶的表达被抑制,衰退病弱株系侵染时甜橙的NADP-异柠檬酸脱氢酶的表达被轻微抑制,暗示感病甜橙植株中NADP-异柠檬酸脱氢酶表达量的变化与衰退病毒侵染力密切关联。多数差异蛋白表达没有被成功验证,但在某种程度上揭示了衰退病诱导差异蛋白表达的不稳定性和复杂性。验证结果总体上仍然支持衰退病不同毒系在诱导甜橙差异表达蛋白的事实。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
第一章文献综述  14-30
  1.1 柑橘衰退病毒研究概况  14-20
    1.1.1 CTV的发生、分布与危害  14
    1.1.2 CTV的寄主范围  14-15
    1.1.3 衰退病的类型  15
    1.1.4 CTV的传播  15
    1.1.5 CTV的基因组特征  15-16
    1.1.6 CTV的株系鉴定  16-19
    1.1.7 CTV的防治  19-20
  1.2 蛋白质组学概况  20
  1.3 柑橘蛋白质组学研究概况  20-25
    1.3.1 柑橘种子蛋白质组研究  20
    1.3.2 柑橘叶片蛋白质组研究  20-21
    1.3.3 柑橘花蛋白质组研究  21
    1.3.4 柑橘果实蛋白质组研究  21-22
    1.3.5 病害侵染与物理损伤胁迫下柑橘蛋白质组研究  22
    1.3.6 盐胁迫下柑橘蛋白质组研究  22-23
    1.3.7 温度胁迫下柑橘蛋白质组研究  23-24
    1.3.8 气体环境胁迫下柑橘蛋白质组研究  24
    1.3.9 激素处理下柑橘蛋白质组研究  24
    1.3.10 其它柑橘蛋白质组研究  24-25
  1.4 蛋白质组学研究技术  25-30
    1.4.1 蛋白质双向凝胶电泳技术  25-26
    1.4.2 胶内差异凝胶电泳技术  26
    1.4.3 蛋白质shotgun技术  26-27
    1.4.4 蛋白质芯片技术  27
    1.4.5 蛋白质组学定量分析技术  27-30
第二章引言  30-32
第三章甜橙叶蛋白质双向凝胶电泳方法的建立  32-48
  3.1 材料与方法  32-43
    3.1.1 实验材料  32
    3.1.2 实验试剂  32-37
    3.1.3 主要仪器  37
    3.1.4 实验方法  37-43
  3.2 结果与分析  43-46
    3.2.1 不同方法提取的甜橙叶总蛋白SDS-PAGE分析  43
    3.2.2 甜橙叶总蛋白2D电泳结果  43-44
    3.2.3 蛋白点的质谱鉴定结果  44-46
  3.3 结论  46-48
第四章 CTV诱导甜橙差异表达蛋白的2D电泳分析与质谱鉴定  48-114
  第一节多个CTV株系诱导甜橙差异表达蛋白的2D电泳分析  48-55
    4.1.1 材料与方法  48
    4.1.2 结果与分析  48-55
  第二节 CTV强弱株系诱导甜橙差异表达蛋白的2D-DIGE电泳分析  55-75
    4.2.1 材料与方法  55-56
    4.2.2 结果与分析  56-75
  第三节差异蛋白的MALDI-TOF/TOF MS/MS质谱鉴定与功能分析  75-114
    4.3.1 材料与方法  75-76
    4.3.2 结果与分析  76-111
    4.3.3 结论与讨论  111-114
第五章 CTV强弱株系影响寄主表达差异蛋白的比较分析  114-118
  5.1 实验材料  114
  5.2 实验方法  114
  5.3 结果与分析  114-118
第六章 CTV诱导差异蛋白表达的RT-QPCR检测  118-124
  6.1 实验材料  118
  6.2 实验方法  118-119
  6.3 结果与分析  119-123
  6.4 结论与讨论  123-124
第七章综合与讨论  124-126
论文的创新点  126-128
参考文献  128-138
附录  138-210
  附录1 123个差异蛋白点的质谱鉴定结果  138-144
  附录2 27个差异蛋白在KEGG中的信息搜索结果表  144-147
  附录3 差异蛋白参与的30种代谢通路图  147-176
  附录4 差异蛋白参与的功能模块  176-196
  附录5 2D-DIGE电泳图谱One-way分析差异蛋白点3D graph图  196-208
  附录6 英文全缩写对照表  208-210
博士期间参加的科研项目及发表的论文目录  210-212
致谢  212

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