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淹水时间对水稻土中地杆菌科细菌群落结构及丰度的影响

作　者: 由焦化
导　师: 王保莉
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 淹水水稻土地杆菌科群落结构丰度 RFLP
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

地杆菌科细菌(Geobacteraceae)是一种非常重要的异化Fe(Ⅲ)还原菌,广泛分布于Fe(Ⅲ)还原环境,如淡水沉积物、有机物或重金属污染的地下水沉积层等环境,具有重要的生物修复功能。周期性的氧化还原状态变化对水稻土中异化铁还原微生物群落结构有着显著的影响,但是目前关于淹水水稻土中非常重要的地杆菌科细菌群落结构及丰度的动态变化鲜有报道。本试验通过模拟水稻土淹水过程,探讨地杆菌科细菌(Geobacteraceae)群落结构和相对丰度随淹水时间的动态变化特征,揭示其群落结构和相对丰度变化与微生物Fe(Ⅲ)还原的内在联系。通过提取汉中(HZ)和浙江(ZJ)水稻土淹水培养1 h、1 d、5 d、10 d、20 d和30 d后的微生物总DNA,构建两种水稻土不同淹水时间样品的地杆菌科细菌16S rDNA克隆文库,采用PCR-RFLP方法分析地杆菌科细菌的群落结构和多样性变化特征,通过Real-time PCR技术测定地杆菌科细菌相对丰度的动态变化,对部分优势类型的克隆子测序并构建系统发育树。采用厌氧泥浆培养方法,测定水稻土中Fe(Ⅱ)产生量变化并用Logistic方程进行拟合,分析地杆菌科细菌群落结构和丰度与Fe(Ⅲ)还原的关系。本试验的主要结果如下:(1)HZ水稻土中,微生物Fe(Ⅲ)还原过程在淹水培养初期变化明显,培养20d后达到稳定期,最大铁还原潜势为10.16 mg/g,最大反应速率为1.064 mg/(g.d),最大反应速率对应的时间为4.84 d;ZJ水稻土淹水培养15 d后Fe(Ⅲ)还原达到稳定期,最大铁还原潜势为8.27 mg/g,最大反应速率为1.341 mg/(g.d),最大反应速率对应的时间为3.36 d。(2)从1 h到30 d的HZ水稻土样品所构建的克隆文库中,分别得到64/155、64/154、76/162、62/152、85/155和54/154个RFLP酶切类型,库容值为61.29%~81.82%;从1 h到30 d的ZJ水稻土样品所构建的克隆文库中,分别得到71/149、74/139、75/153、72/150、73/151和61/153,库容值为64.75%~73.86%。(3)α多样性指数显示,汉中水稻土中地杆菌科细菌的多样性随淹水时间延长呈现波动性变化,淹水5 d和20 d处理出现2个峰值,而淹水10 d和30 d处理的多样性明显减小;浙江水稻土中地杆菌科细菌的多样性随淹水时间延长先增加后逐渐减少,淹水1 d多样性最高,30 d处理的多样性最低。两种水稻土中β多样性指数表明,淹水过程中地杆菌科细菌群落结构存在明显差异。(4)不同淹水时间的汉中水稻土共产生了10种地杆菌科细菌优势类型,分别属于Clade 1和Clade 2;浙江水稻土同样产生了10种地杆菌科细菌优势类型,在Clade 1、Clade 2和Clade GM中均有分布,但均与来自淡水表层沉积物和受污染的水体的参比菌株距离较远。(5)Real-time PCR结果表明,汉中水稻土中地杆菌科细菌与总细菌16S rDNA丰度的比值在淹水培养1 d时最小(1.20%),而20 d时达到最大值(4.54%);浙江水稻土中,地杆菌科细菌的相对丰度在淹水培养1 d时最小(0.413%),而10 d时达到最大值(4.111%)。通过上述结果可以得出,淹水厌氧培养的水稻土中,地杆菌科细菌的多样性和相对丰度随时间发生了动态变化,这种动态变化与Fe(Ⅲ)还原过程密切相关。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章绪论  11-25
  1.1 水稻土与Fe(Ⅲ)还原  11-12
  1.2 异化 Fe( Ⅲ )还原微生物及其多样性  12-14
    1.2.1 异化Fe(Ⅲ)还原  12-13
    1.2.2 异化Fe(Ⅲ)还原菌多样性  13-14
  1.3 异化Fe(Ⅲ)还原菌生理学多样性  14-18
    1.3.1 电子受体  15-17
    1.3.2 电子供体和氢气  17-18
  1.4 微生物群落结构的分子生物学技术  18-22
    1.4.1 限制性片段长度多态性分析  19-20
    1.4.2 末端标记限制性片段长度多态性分析  20
    1.4.3 变性梯度凝胶电泳  20-21
    1.4.4 单链构象多态性分析  21
    1.4.5 实时定量PCR  21-22
  1.5 16S rDNA 在地杆菌科群落分析中的应用  22
  1.6 地杆菌科的研究进展  22-23
  1.7 研究的目的意义、主要内容与技术路线  23-25
    1.7.1 研究的目的意义  23
    1.7.2 研究内容  23-24
    1.7.3 技术路线  24-25
第二章材料与方法  25-32
  2.1 材料  25-27
    2.2.1 供试土壤  25
    2.1.2 试剂  25-26
    2.1.3 主要仪器设备  26
    2.1.4 引物和菌种  26
    2.1.5 主要应用软件  26-27
  2.2 试验方法  27-32
    2.2.1 供试土样的采集  27
    2.2.2 厌氧恒温培养及土样中Fe(Ⅲ)还原量测定  27
    2.2.3 上游引物设计  27-28
    2.2.4 感受态细胞的制备  28
    2.2.5 土壤中总DNA 的提取  28
    2.2.6 总DNA 的纯化  28
    2.2.7 地杆菌科16S rDNA 片段的PCR 扩增与纯化  28-29
    2.2.8 地杆菌科16S rDNA 克隆文库的构建  29
    2.2.9 地杆菌科16S rDNA 的RFLP 分型  29-30
    2.2.10 地杆菌科16S rDNA 系统发育分析  30
    2.2.11 实时定量PCR  30
    2.2.12 多样性指数计算  30-32
第三章结果与分析  32-47
  3.1 淹水过程中Fe(Ⅱ)的动态变化  32-33
  3.2 土壤中总DNA 的提取  33
  3.3 地杆菌科16S rDNA 的PCR 扩增  33-34
  3.4 地杆菌科16S rDNA 克隆文库中菌落PCR  34
  3.5 16S rDNA 克隆文库酶切聚类分析  34-36
  3.6 RFLP 类型统计  36-38
  3.7 地杆菌科16S rDNA 克隆文库多样性分析  38-40
  3.8 优势菌类型的演替变化  40-42
  3.9 淹水条件下水稻土中优势地杆菌科的系统发育树  42-44
  3.10 水稻土中地杆菌科及细菌丰度的动态变化  44-45
  3.11 本章小结  45-47
第四章讨论  47-50
  4.1 淹水培养时间与土壤中地杆菌科多样性的关系  47-48
  4.2 淹水培养时间与土壤中地杆菌科优势类型演替的关系  48
  4.3 土壤中地杆菌科丰度变化与Fe(Ⅲ)还原能力的关系  48-49
  4.4 上游引物的特异性  49-50
第五章结论和展望  50-52
  5.1 结论  50
  5.2 展望  50-52
参考文献  52-58
附录  58-82
致谢  82-83

淹水时间对水稻土中地杆菌科细菌群落结构及丰度的影响

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