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南方红黄壤地区土壤微生物碳素循环相关基因多样性研究

作　者: 陈森林
导　师: 曹慧
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 红黄壤 RFLP DGGE Rubisco mcrA 微生物多样性
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


土壤是陆地生态系统最重要的碳库,土壤有机碳含量的变化受多种人为和自然因素的影响。其中微生物扮演了重要的角色,它参与了土壤有机碳的固定和再生,土壤是作为碳库还是碳源相当程度上取决于土壤中碳素循环微生物的群落结构特征。CO2的固定和温室气体的释放是碳素循环的两个重要过程,相关功能微生物参与其中,而cbbL和mcrA是这两个过程的标记基因。本研究主要通过PCR扩增、基因克隆、DGGE、RFLP和序列分析等对红壤环境中的16S rDNA、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因cbbL和甲基辅酶还原酶基因mcrA的分子多样性进行了分析,探讨了江西红壤和南京黄棕壤四种样品,即江西未施肥水稻土(JX-CK)、江西施肥水稻土(JX-S)、南京林地(NJ-F)及南京菜地(NJ-V)参与碳素循环相关的功能基因多样性特征。通过平板计数比较了南京黄棕壤和江西红壤四种样品的微生物生物量,结果表明：(1)江西红壤两个样品细菌和放线菌的数量低于南京的两个样品,而真菌的数量较高,微生物数量量总体偏低；(2)南京菜地土和江西施肥稻田土的微生物数量略高于同区域的林地和未施肥土壤,施肥在一定程度上可以提高土壤的微生物数量。采用DGGE技术研究南京黄棕壤和江西红壤土壤微生物的多样性。图谱分析表明,两种土壤的微生物多样性均很丰富,红壤的微生物种类略高于黄棕壤,两种土壤微生物群落结构差异很大。红壤水稻田优势菌群相对集中,而南京林地的优势菌群相对分散,经开垦成为菜地后,优势菌群产生一定的改变,但没有产生集中,对微生物群落的影响程度,表现为土壤类型>利用方式>施肥方式。通过构建南京黄棕壤和江西红壤四个cbbL基因文库,获得了38个OTUs。江西红壤水稻土两处理有着共同的主要类群,而南京黄棕壤林地与菜地之间的主要类群不同。通过RFLP分析和多样性指数计算发现,四个文库库容值均很高(94.12%-98.46%)。红壤的多样性指数要略高于黄棕壤,而施用有机肥对于黄棕壤中cbbL基因多样性指数略有提高,而施用无机肥大幅降低江西红壤水稻田的cbbL基因多样性。四个文库之间的相似性很低,说明cbbL基因在土壤微域空间中的变异大。通过构建系统发育树,发现土壤中cbbL基因在纲以上的微生物中有广泛的分布,具有高度的多样性。在土壤中主要分布类群为藻类和化能自养细菌,其中藻类包括蓝藻和绿藻,化能自养细菌包括硫杆菌和硝化杆菌。蓝藻为南京林地的cbbL基因分布的主要类群,经开垦施肥成为菜地后,其主要类群转变为硝化杆菌中的硝酸细菌。江西红壤水稻田cbbL基因主要分布于绿藻中。施加NPK肥使水稻田主要类群绿藻的比例大幅提升,第二大类群由蓝藻转变为硝化杆菌。研究了两种土壤在不同施肥条件下产甲烷菌群落结构多样性。PCR-RFLP和测序分析对四种不同处理下产甲烷菌甲基辅酶还原酶基因mcrA基因的多样性和系统发育进行了研究分析。总共225个克隆子被分为13种RFLP类型。通过RFLP分析和多样性指数计算发现,四个文库都有比较高的覆盖值,代表了环境中主要的产甲烷菌类群。四种文库中的基因的mcrA多样性均匀性较低,而且也存在着主要类群的产甲烷细菌,主要以未培养的产甲烷菌为主,在南京菜地土和江西水稻田中Methanobacterium formicicum和Methanobacterium subterraneum属于重要类群。四文库之间的相似性在50%左右,多样性指数较低且差别不显著。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11符号与缩略语说明  11-12前言  12-13第一章 文献综述  13-37  1 微生物碳素循环研究进展  13-15    1.1 固定CO_2的微生物  13-14    1.2 微生物固定CO2的途径  14-15  2 Rubisco基因研究进展  15-18    2.1 Rubisco的分布与定位  15    2.2 Rubisco基因类型  15-17    2.3 RubisCO基因的多样性研究进展  17-18  3 产甲烷菌研究进展  18-24    3.1 产甲烷菌的研究历史及分类  18-20    3.2 产甲烷菌的生态环境  20-24  4 土壤微生物多样性及其研究方法进展  24-29    4.1 土壤微生物多样性  24-25    4.2 土壤微生物多样性研究方法进展  25-29  参考文献  29-37第二章 江西鹰潭红壤与南京黄棕壤微生物群落多样性的DGGE分析  37-53  1 材料及方法  37-42    1.1 研究区域概况  37-38    1.2 样品的采集,编号及处理  38    1.3 实验试剂  38    1.4 土壤理化性质的测定及微生物计数  38-39    1.5 土壤总DNA的提取与纯化  39-40    1.6 土壤16S rDNA V3区扩增与纯化  40-41    1.7 16S rDNA V3区的DGGE分析  41    1.8 DGGE指纹图谱分析  41    1.9 群落结构多样性评价指数的计算方法  41-42  2 结果与分析  42-48    2.1 土壤理化性质  42-43    2.2 四种土样的三大菌群的计数结果  43    2.3 土壤总DNA的提取  43-44    2.4 土壤16S rDNA V3区扩增与纯化  44    2.5 DGGE指纹图谱分析四种土壤的微生物群落结构  44-46    2.6 DGGE群落相似性及微生物多样性聚类分析  46-47    2.7 通过DGGE图谱对于土壤微生物的多样性指数分析  47-48  3 讨论  48  4 结论  48-50  参考文献  50-53第三章 江西鹰潭红壤与南京黄棕壤中Rubisco基因多样性研究  53-69  1 材料及方法  53-59    1.1 实验试剂  53-54    1.2 样品的采集及保存  54    1.3 土壤总DNA的提取与纯化  54    1.4 cbbL基因与cbbM基因的扩增与纯化  54-55    1.5 大肠杆菌高效感受态的制备  55-56    1.6 PCR产物的TA克隆  56    1.7 酶连产物的转化  56    1.8 土壤cbbL基因文库的构建、检查及保存  56-57    1.9 文库克隆的酶切分析  57-58    1.10 文库的统计分析  58-59    1.11 序列测定和系统进化树构建  59  2 结果与分析  59-66    2.1 cbbL基因与cbbM基因的扩增  59-60    2.2 cbbL基因克隆子插入片段的扩增  60-61    2.3 cbbL基因文库酶切类型的统计分析  61-62    2.4 四种cbbL基因文库的库容分析  62-63    2.5 四种cbbL基因文库的多样性指数分析  63-64    2.6 四种cbbL基因文库的群落结构相似性分析  64    2.7 cbbL基因文库测序分析和系统发育树构建  64-66  3 讨论  66-67  4 结论  67-68  参考文献  68-69第四章 江西鹰潭红壤与江苏南京黄棕壤产甲烷菌多样性研究  69-81  1. 材料及方法  69-74    1.1 实验试剂  69    1.2 样品的采集、保存及理化性质  69    1.3 土壤总DNA的提取与纯化  69-70    1.4 产甲烷菌Mcra基因片段扩增、纯化  70    1.5 大肠杆菌高效感受态的制备  70-71    1.6 PCR产物的TA克隆  71    1.7 酶连产物的转化  71    1.8 土壤Mcra基因文库的构建、检查及保存  71    1.9 文库克隆的酶切分析  71-73    1.10 文库的统计分析  73    1.11 序列测定和系统进化树构建  73-74  2 结果与分析  74-79    2.1 mcrA基因的扩增与纯化  74    2.2 mcrA基因文库克隆插入片段的扩增  74-75    2.3 mcrA基因文库酶切类型的统计分析  75-76    2.4 mcrA基因文库库容分析  76    2.5 mcrA基因文库多样性指数分析  76-77    2.6 mcrA基因文库相似性分析  77    2.7 mcrA基因文库测序分析及系统发育树的构建  77-79  3 结论  79-80  参考文献  80-81全文总结  81-83创新之处  83-85附录 文中所用的培养基和试剂配方  85-89致谢  89

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