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内切葡聚糖酶基因同源和异源结构域重构研究

作　者: 唐自钟
导　师: 陈惠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 枯草芽胞杆菌 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 毕赤酵母 内切葡聚糖酶 真菌Corticium rolfsii 同源结构域重构 异源结构域重构
分类号: Q556.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶(endo-glucanase),外切葡聚糖酶(exoglucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase),这三种酶将纤维素最终转化成为葡萄糖。近年来随着纤维素酶广泛应用,细菌纤维素酶制剂也越来越受到人们的重视,然而,纤维素酶大规模应用及生产中受到酶活较低以及成本较高的限制。本文利用基因工程手段实现了对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切葡聚糖酶基因和来源于真菌Corticium rolfsii(Strain AHU9627)的内切葡聚糖酶基因进行了同源和异源结构域重构并分别在大肠杆菌(BL21)和毕赤酵母(GS115)中进行表达,同时对其表达产物进行了相关的酶学性研究。1.以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切葡聚糖酶基因序列(GenBank Accession:DQ782954)为模板设计引物,根据生物信学方法对其编码的蛋白质序列的蛋白质结构分析表明,该内切葡聚糖酶的活性中心部位由一个长约82aa的底物结合结构域(CBD)和一个长约253aa的催化结构域(CD)组成,中间有55aa的链接肽(CP),并在NCBI上分析来源于真菌Corticium rolfsii(Strain AHU9627)的内切葡聚糖酶基因,对其蛋白质的活性位点进行分析,分析得出其来源于AHU9627纤维素酶基因的结合结构域及连接肽区域(命名为FCBD)的编码序列GenBank Accession No.:D49448,分别设计带有相应酶切位点的各片段引物并由英骏公司合成。采用PCR技术扩增得到各目的片段。成功构建了在原始基因上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域(命名为FCBD)的编码序列,将去除信号肽的原始基因和增加FCBD的重构基因成功地构建了pET32a载体,并转化至大肠杆菌表达菌株(Escherichia coli)BL21。分别命名为pET32a/EG和pET32a/EG/FCBD,筛选获得阳性菌落重组转化子,刚果红染色检测其内切葡聚糖酶活性,经1mmol/L的IPTG诱导4-6h,最高酶活分别可达到94.38978 U/mL和174.3079U/mL,SDS-PAGE电泳分析pET32a/EG和pET32a/EG/FCBD两重构体酶分子量大小为72KD和80KD。酶活性比较显示增加了来源于真菌的FCBD结构的重构体pET32a/EG/FCBD酶的活性是对照菌株pET32a/EG的1.8倍。酶学性质分析表明：两种酶的最适反应温度并无太大差别,均为60℃,最适pH值为分别为6.5和7.0,在30℃-75℃和pH4.5-pH10.0处理后其残余酶活均能达到最高酶活的50%以上。2.本实验成功构建了在原始基因上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域的(命名为FCBD)编码序列、以及删除糖结合模块上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域的(命名为FCBD)编码序列,并将其成功插入pPIC9k表达载体上,分别构建了pPIC9k/EG/FCBD, pPIC9k/CD/FCBD重组载体。将重组表达载体经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,用酶活测定的方法,得到高酶活工程菌,命名为9KEGF和9KCDF,并将其与实验室已经构建的去掉信号肽(EG1)、增加催化域(EG2)、糖结合模块(EG3)以及删除糖结合模块(EG4)的内切葡聚糖重构酶基因转入毕赤酵母中获得高酶活转化子的工程菌株同时进行诱导表达,酶学性质分析结果显示,EG1、EG2、EG3、EG4的最适反应温度分别为45℃、55℃、40℃、55℃、55℃、40℃,其酶活最高分别达到885U/mL、770U/mL、797U/mL、918U/mL、779/mL；、874/mL。最适pH有一定的差别,EG1和EG2的最适pH为pH=7.0,EG3、EG4和9KCDF有共同的最适pH,为pH=5.6;9KEGF的最适pH为6.5.温度稳定性没有太明显的差异,在温度为70℃时,EGl和9KEGF的酶活可达到最高酶活的70%以上,EG4和9KCDF酶活可达最高酶活的60%以上,但在此温度下,EG2和EG3酶活下降很明显,分别只达到最高酶活的13.8%和21%。六株重构体酶均表现出较强的碱耐受性,但其保持在最大酶活的80%以上时其pH大至都在pH=6.5-8.0之间,随着pH值的进一步增加,其酶活均有降低,EG2在pH=10时酶活出现明显的降低,其达五株重构体酶,在pH=10时,酶活均能保持在最高酶活的60%以上。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-12
第一章 文献综述  12-25
  1 纤维素的研究进展  12-14
    1.1 纤维素的分子结构  12-13
    1.2 纤维素底物类型  13-14
      1.2.1 可溶性纤维素底物  13
      1.2.2 不溶性纤维素底物  13-14
  2 纤维素酶的研究进展  14-18
    2.1 纤维素酶的来源  14
    2.2 纤维素酶的组成和作用机制  14-15
    2.3 纤维素酶的分子结构  15-16
    2.4 纤维素酶的分子酶工程研究进展  16-18
  3 大肠杆菌表达系统研究进展  18-21
    3.1 大肠杆菌表达系统的特点  18
    3.2 大肠杆菌的基因工程  18-21
      3.2.1 大肠杆菌的组成  18-20
      3.2.2 外源基因的融合表达  20-21
  4 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展  21-25
    4.1 毕赤酵母表达系统的优点  21-22
    4.2 在酵母表达载体中高效表达外源基因的策略  22-23
      4.2.1 毕赤酵母的组成  22-23
      4.2.2 利用酵母菌表达外源基因的步骤  23
    4.3 酵母表达载体中高效表达外源基因的策略  23-25
第二章 异源重构内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达研究  25-50
  1 材料  25-28
    1.1 菌株与载体  25
    1.2 试剂与溶液  25-26
    1.3 培养基  26
    1.4 主要仪器  26
    1.5 常用缓冲液及其抗生素的配制  26-28
      1.5.1 内切葡聚糖酶酶活力测定的溶液配置  26-27
      1.5.2 抗生素贮存液的配制  27
      1.5.3 主要的琼脂糖电泳试剂  27-28
      1.5.4 刚果红染色液  28
  2 实验方法  28-38
    2.1 重组表达载体构建  28-35
      2.1.1 内切葡聚糖酶基因和真菌基因(FCBD)片段的准备  28-32
      2.1.2 表达载体片段的准备  32-33
      2.1.3 载体连接  33
      2.1.4 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备  33-34
      2.1.5 转化  34
      2.1.6 阳性克隆子的筛选及鉴定  34-35
    2.2 重构体菌株的诱导表达  35-36
      2.2.1 重构体菌株的IPTG诱导  35-36
      2.2.2 重构体菌株的水解圈分析  36
      2.2.3 重构酶的SDS-PAGE分析  36
    2.3 重构体酶的酶学性质分析  36-38
      2.3.1 重构酶活性的测定方法  36-37
      2.3.2 重构酶的最适温度的测定  37
      2.3.3 重构酶的最适pH值的测定  37
      2.3.4 重构酶热稳定性的测定  37
      2.3.5 重构酶pH稳定性的测定  37-38
      2.3.6 不同诱导温度对酶活力的影响  38
      2.3.7 诱导时间对重构酶活力的影响  38
      2.3.8 重构酶用不同IPTG诱导浓度对酶活力的影响  38
  3 实验结果  38-48
    3.1 高保真酶扩增结构域编码基因片段序列  38-40
    3.2 重构表达载体的构建  40-41
    3.3 重构体的IPTG诱导表达及水解圈活性分析  41-43
      3.3.1 重构酶的IPTG诱导表达  41-42
      3.3.2 重构酶的水解圈分析  42
      3.3.3 重构酶的SDS-PAGE分析  42-43
    3.4 重构体酶的酶学性质分析  43-48
      3.4.1 重构酶的最适温度的测定  43-44
      3.4.2 重构酶的最适pH值的测定  44-45
      3.4.3 重构酶热稳定性的测定  45
      3.4.4 重构酶的pH值稳定性的测定  45-46
      3.4.5 最适诱导温度  46
      3.4.6 诱导时间对重构酶活力的影响  46-47
      3.4.7 重构酶用同IPTG诱导浓度对酶活力的影响  47-48
  4 讨论  48-50
第三章 内切葡聚糖酶结构域异源重构与同源重构研究  50-71
  1 材料  50-53
    1.1 菌株与载体  50-51
    1.2 试剂与溶液  51-52
      1.2.1 各种母液的配制  51-52
      1.2.2 各种培养基的配制  52
    1.3 主要仪器  52-53
  2 方法  53-58
    2.1 异源重构基因重组表达载体构建  53-56
      2.1.1 异源重构各结构域片段准备  53-54
      2.1.2 表达载体片段的准备  54-55
      2.1.3 表达载体连接  55
      2.1.4 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备  55
      2.1.5 转化  55
      2.1.6 阳性克隆子的筛选及鉴定  55-56
    2.2 异源重构重组表达载体的电击转化  56-57
      2.2.1 线性化重组表达载体  56
      2.2.2 毕赤酵母感受态细胞GS115的制备  56
      2.2.3 毕赤酵母的电击转化  56-57
    2.3 重组酵母的诱导表达  57
      2.3.1 高效表达酵母重构菌株的筛选  57
      2.3.2 异源重构体酶的SDS-PAGE分析  57
    2.4 经同源重构和异源重构后重组酵母的酶学性质分析  57-58
      2.4.2 重构酶的最适温度的测定  57-58
      2.4.3 重构体酶的最适pH值的测定  58
      2.4.4 重构酶热稳定性的测定  58
      2.4.5 重构酶pH稳定性的测定  58
  3 结果  58-67
    3.1 异源重构各结构域基因片段的高保真酶扩增  58-59
    3.2 异源重构基因重组表达载体构建  59-61
    3.3 异源重构体酶重组酵母的诱导表达  61-63
      3.3.1 重构体酶的高表达菌株筛选  61-62
      3.3.2 重构体酶的SDS-PAGE分析  62-63
    3.5 异源重构体重组酶酶学性质分析  63-67
      3.5.1 重构体酶最适反应温度  63-64
      3.5.2 重构体酶最适反应pH  64-65
      3.5.3 重构体酶的温度稳定性分析  65-66
      3.5.4 重构体酶pH稳定性  66-67
  4 讨论  67-71
参考文献  71-76
致谢  76

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 水解酶 > 水解糖苷键的酶
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