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基于宏基因组筛选高温大曲纤维素酶的基因及细菌菌群结构多样性分析

作　者: 龚丽琼
导　师: 黄祖新
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物
关键词: 高温大曲 宏基因组文库 产纤维素酶基因 核糖体扩增片段限制性内切酶分析 单链构象多态性分析
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


高温大曲是采用富含蛋白质的谷物作为主要原料,以开放性培养的制曲工艺,在60～65℃的制曲温度下产生了多种嗜热性芽孢杆菌及热稳定性良好的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等酶类,并且产生高温大曲中独特的微生物群落。本论文第1部分：以福矛高温大曲为材料,基于宏基因组学方法筛选纤维素酶基因。首先提取高温大曲的宏基因组总DNA,以Fosmid为载体,构建了一个包含10000个克隆子的高温大曲宏基因组文库,从中筛选得到2株产纤维素酶的阳性克隆子,复筛确定纤维素酶酶活最高的一株阳性克隆子,命名为G1并进行酶学性质初步分析。提取G1的质粒酶切后与pUC18-T载体连接,构建亚克隆文库,通过进一步筛选,将产纤维素酶基因片段缩小至1169bp左右。将该基因片段进行全测序,分析表明该基因片段的核酸序列与地衣芽孢杆菌(GenBank登录号CP000002.3)核酸序列具有100%的相似性；该核酸序列包含一个由147个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),根据糖基水解酶命名法则,将该基因命名为umcellH。用SMART软件分析表明umcellH前体的N端的第1-22个氨基酸是可能的信号肽；用DNAMAN软件分析表明,umcellH编码的蛋白质预计分子量大小为5243.4Da,等电点为11.3。本论文第2部分：运用核糖体扩增片段限制性内切酶分析(Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA)技术及单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymor-phism, SSCP)技术对大曲的细菌菌群结构进行分析。以ARDRA技术分析高温大曲的细菌菌群,建立了培养法和非培养法文库,培养法文库中90个克隆子得到23种OTUs,非培养法文库中96个克隆子得到34种OTUs。在文库的标准多样性指数方面,非培养法文库的香侬-威纳指数(Shannon-Weiner index)、辛普森指数(Simpson index)、丰富度指数(Margalefs richness index)分别为3.11、0.077、7.23,均高于培养法文库中对应的多样性指数(分别为3.02、0.062、4.89)；两种文库均一度指数(Evenness index)均为0.88,说明具有良好的多样性。两种文库的各指数分析说明,非培养法在揭示大曲微生物多样性时要优于培养法。运用PCR-SSCP技术研究高温大曲表层、侧面、中心三个不同部位的微生物群落结构,通过提取不同部位的总DNA,分别扩增其16SrDNA的V4-V5区域,将扩增产物进行酶切、变性,得到的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,结果显示高温大曲中心处的微生物最丰富。

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-9
目录  9-12
绪论  12-24
  1 课题背景  12-15
  2 宏基因组研究  15-21
    2.1 总DNA的提取和纯化  16-18
    2.2 构建宏基因组文库  18
    2.3 宏基因组文库的筛选  18-21
  3. 高温大曲微生物菌群结构多样性的研究  21-22
    3.1 ARDRA分析大曲的微生物多样性研究  21-22
    3.2 PCR-SSCP技术分析高温大曲不同部位的微生物情况  22
  4 本论文研究的意义和内容  22-24
第一章 宏基因组文库的构建  24-34
  第一节 前言  24
  第二节 材料和方法  24-28
    2.1 材料  24-25
    2.2 方法  25-28
  第三节 实验结果  28-32
    3.1 高温大曲总DNA的初步提取  28-29
    3.2 DNA的纯化  29-31
    3.3 宏基因组文库的构建  31-32
    3.4 宏基因组文库插入片段的多样性分析  32
  第四节 讨论  32-34
第二章 宏基因组文库产纤维素酶基因的筛选及酶学性质分析  34-42
  第一节 前言  34
  第二节 材料和方法  34-36
    2.1 材料  34-35
    2.2 方法  35-36
  第三节 实验结果  36-40
    3.1 产纤维素酶克隆子筛选  36-38
    3.2 产纤维素酶阳性克隆子酶学性质分析  38-40
  第四节 讨论  40-42
第三章 大曲宏基因组文库产纤维素酶基因的亚克隆  42-52
  第一节 前言  42
  第二节 材料和方法  42-43
    2.1 材料  42
    2.2 方法  42-43
  第三节 实验结果  43-49
    3.1 制备连接所需载体  44
    3.2 质粒酶切  44-45
    3.3 重组质粒验证  45-46
    3.4 亚克隆阳性克隆验证  46-47
    3.5 基因序列分析  47-49
  第四节 讨论  49-52
第四章 培养法和非培养法分析大曲的微生物多样性  52-64
  第一节 前言  52
  第二节 材料和方法  52-55
    2.1 材料  52
    2.2 高温大曲16s rDNA文库的构建  52-54
    2.3 ARDRA分析  54-55
    2.4 标准多样性指数的计算  55
    2.5 克隆子16S rDNA的测序和系统发育分析  55
  第三节 实验结果  55-63
    3.1 PCR模板DNA的制备  55-57
    3.2 16S rDNA的PCR扩增及胶回收  57-58
    3.3 16S rDNA文库插入片段验证  58-59
    3.4 ARDRA分析  59
    3.5 两种文库的各指数比较  59-60
    3.6 16S rDNA非培养法文库的克隆子测序及系统发育进化树构建  60-63
  第四节 讨论  63-64
第五章 高温大曲不同部位的微生物群落结构的PCR-SSCP分析  64-72
  第一节 前言  64
  第二节 材料和方法  64-66
    2.1 材料  64-65
    2.2 实验方法  65-66
  第三节 实验结果  66-70
    3.1 大曲不同部位的PCR扩增  67
    3.2 SSCP电泳优化  67-68
    3.3 PCR-SSCP结果  68-70
    3.4 高温大曲的微生物群落结构PCR-SSCP分析  70
  第四节 讨论  70-72
第六章 结论  72-74
  1 高温大曲宏基因组文库的构建  72
  2 高温大曲宏基因组文库中产纤维素酶基因片段的筛选  72
  3 高温大曲宏基因组文库产纤维素酶基因的亚克隆  72
  4 高温大曲微生物菌群结构的ARDRA分析  72-73
  5 高温大曲不同部位的微生物群落结构的PCR-SSCP分析  73-74
附录  74-114
参考文献  114-124
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  124-126
致谢  126-128
个人简历  128-129

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 酿酒工业 > 酿酒微生物 > 酵母（各种曲）
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