学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

作　者: 谭婉新
导　师: 冯家勋
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 未培养微生物宏基因组文库内切葡聚糖酶克隆表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 49次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本工作从牛瘤胃的富集培养物中提取未培养细菌的总DNA，用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建宏基因组文库，得到一个包含约8千个克隆的宏基因组文库。该文库外源片段最大为50.8kb，最小约20.5kb，平均大小为35.6kb，外源总DNA容量约为2.86×108bp。对文库进行活性筛选，获得1个表达既表达内切酶活性又表达4-MUC活性的克隆，对具有活性的克隆进行亚克隆、测序分析。鉴定分析表明：该克隆上潜在的内切酶基因umce／5K具1个1002bp的ORF(Open Reading Frame)，可编码含333个氨基酸的蛋白质。umce／5K蛋白与一个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶CelA(ABA02176)同源性最高，一致性为53％、相似性为68％；其次与来自混合纤维弧菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶CelA(AAB61461)一致性为51％、相似性为67％。将该ORF转入表达载体后用IPTG诱导表达Umcel 5K蛋白，经过Ni-NTA纯化后测定其酶学特性。Umcel 5K最适pH和最适温度分别为5.0和50℃。从Umcel 5K的pH耐受性和热稳定性实验中可知，Umcel 5K较适合偏酸酸性的环境，是个中温酶，不耐高温。其Km值为3.843mg／ml，Vmax为152.4U／mg。部分金属如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活，而另外一些金属离子如K~+、Li~+等对Umcel 5K的活性影响不大。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章前言  9-22
  1.1 纤维素的结构及降解  9-12
    1.1.1 纤维素的结构  9-10
    1.1.2 分解纤维素的微生物  10-12
  1.2 纤维素酶概述  12-17
    1.2.1 纤维素酶的种类  12
    1.2.2 降解纤维素的机理  12-13
    1.2.3 纤维素酶的分子结构和功能  13-15
    1.2.4 纤维素酶的研究进展  15
    1.2.5 纤维素酶的应用  15-17
  1.3 宏基因组技术及应用  17-21
    1.3.1 宏基因组技术  17-21
    1.3.2 宏基因组技术的应用  21
  1.4 本研究的目的和意义  21-22
第二章材料与方法  22-38
  2.1 材料  22-25
    2.1.1 样品采集  22
    2.1.2 牛瘤胃样品的富集  22
    2.1.3 菌种保存  22
    2.1.4 菌株和质粒  22-23
    2.1.5 培养基、培养条件和抗生素  23-25
  2.2 方法  25-38
    2.2.1 质粒提取  25-26
    2.2.2 DNA的酶切、连接和电泳  26
    2.2.3 电透析洗脱法回收DNA片段  26-27
    2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒的转化  27-28
    2.2.5 牛瘤胃样品宏基因组DNA的提取  28-29
    2.2.6 牛瘤胃样品宏基因组DNA的纯化  29-30
    2.2.7 水牛瘤胃富集培养物宏基因组文库的构建  30-31
    2.2.8 文库中表达纤维素酶活性克隆的筛选  31-32
    2.2.9 文库中纤维素酶基因的克隆  32
    2.2.10 PCR引物设计与基因扩增  32-33
    2.2.11 基因的表达与检测  33
    2.2.12 SDS-PAGE蛋白质电泳  33-34
    2.2.13 SDS-PAGE电泳过程  34-35
    2.2.14 蛋白质浓度测定  35
    2.2.15 重组蛋白的纯化  35-36
    2.2.16 内切葡聚糖酶的酶活测定  36-38
第三章结果与分析  38-55
  3.1 牛瘤胃未培养微生物的富集培养  38
  3.2 牛瘤胃样品的富集培养  38-39
  3.3 牛瘤胃富集培养微生物总DNA的提取及纯化  39-40
    3.3.1 宏基因组DNA的提取  39
    3.3.2 宏基因组DNA的纯化  39-40
  3.4 宏基因组文库的构建及评价  40-41
  3.5 宏基因组文库中纤维素酶活性克隆的筛选  41-42
  3.6 内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆和鉴定  42-46
    3.6.1 EPI100/pC3的亚克隆  42
    3.6.2 umcel5K基因的鉴定与序列分析  42-46
  3.7 umcel5K基因的表达与表达产物Umcel5K的纯化  46-48
  3.8 Umcel5K的酶学特性分析  48-55
    3.8.1 内切葡聚糖酶Umcel5K的纯化结果  48-49
    3.8.2 Umcel5K的最适反应pH值  49-50
    3.8.3 Umcel5K的最适反应温度  50-51
    3.8.4 Umcel5K的pH耐受性  51-52
    3.8.5 Umcel5K的温度耐受性  52-53
    3.8.6 Umcel5K的酶反应动力学常数Km和Vmax测定  53
    3.8.7 金属离子、螯合剂、表面活性剂对Umcel5K酶活力的影响  53-55
第四章结果分析与讨论  55-58
  4.1 样品采集和培养  55
  4.2 文库的构建  55-56
  4.3 umcel5K基因的筛选与鉴定  56
  4.4 重组内切葡聚糖酶Umcel5K的纯化和酶学特性鉴定  56-57
  4.5 内切葡聚糖酶的应用前景  57-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
参与的科研、取得的奖励和发表论文情况  65

一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

内容摘要

全文目录

相似论文