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双峰驼瘤胃细菌多样性及宏基因组文库构建与初步筛选

作　者: 张玲
导　师: 罗明
学　校: 新疆农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 双峰驼 ARDRA T-RFLP 细菌多样性宏基因组文库
分类号: S824
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

瘤胃微生物在反刍动物营养物质消化吸收中起着举足轻重的作用,在饲料、瘤胃调控、食品发酵和生物质利用等领域中具有极大的应用潜力。本试验采用免培养技术分析新疆双峰驼瘤胃细菌多样性,明确其种群组成;构建宏基因组文库,并从中筛选有价值的功能基因,为今后进一步开发利用瘤胃微生物提供科学基础和技术平台。研究取得了以下结果:研究建立了一种简便快速地从双峰驼瘤胃微生物细胞中提取总DNA的方法,采取冻融-酶-SDS相结合的直接提取法,提取得到的瘤胃微生物总DNA较完整,片段大于23 kb。构建了双峰驼瘤胃细菌16S rDNA克隆文库,该文库的覆盖率达到57%,Shannon-Wiener index(H′)多样性指数为4.57。采用ARDRA技术分析该文库中的331个阳性克隆,得到130个可操作分类单元(OTUs)。分析结果显示在瘤胃内存在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门、TM7和未分类细菌,其中厚壁菌门为优势菌群,占63.8%。利用T-RFLP技术分析显示在双峰驼瘤胃内存在变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、柔膜菌门、绿弯菌门和浮霉菌门。研究结果说明两种方法结合可检测到的菌群种类更加丰富。经分析双峰驼瘤胃细菌与GeneBank数据库中已知序列相似性在85%-99%之间,相似率大于97%部分只占35.4%,未知序列占64.6%,表明双峰驼瘤胃细菌中只有少数为已知种,大多为未知的新属、种或潜在的其他新的分类单元;其中可培养细菌仅占5.4%,未培养占94.6%。以经过酶切的瘤胃微生物总DNA为插入片段,以pBluescriptSK(+)为载体构建了质粒宏基因组文库。对424个克隆进行CMCase和β-1,4-葡萄糖苷酶活性筛选,初步筛选后,有30个克隆表现β-1,4-葡萄糖苷酶活性,有6个克隆表现CMCase活性,这些有活性的克隆还有待进一步分析鉴定。本研究结果为发掘双峰驼瘤胃微生物的生物功能、利用瘤胃微生物遗传资源提供了重要的技术平台。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章绪论  8-23
  1.1 立题背景  8-9
  1.2 相关领域国内外研究进展  9-16
  1.3 微生物宏基因组文库的构建与分析  16-20
  1.4 研究内容  20-22
  1.5 技术路线  22-23
第2章双峰驼瘤胃微生物总DNA 的提取与纯化  23-28
  2.1 材料与方法  23-24
  2.2 结果与分析  24-26
  2.3 结论与讨论  26-28
第3章基于免培养技术的双峰驼瘤胃细菌多样性分析  28-50
  3.1 材料与方法  28-31
  3.2 结果与分析  31-47
  3.3 结论与讨论  47-50
第4章双峰驼瘤胃微生物宏基因组文库构建和功能酶活性克隆的初步筛选  50-58
  4.1 材料与方法  50-53
  4.2 结果与分析  53-57
  4.3 结论与讨论  57-58
第5章结论  58-60
参考文献  60-66
致谢  66-67
作者简介  67

双峰驼瘤胃细菌多样性及宏基因组文库构建与初步筛选

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