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应用PCR-DGGE分析高温制曲中细菌群落变化的研究

作　者: 张春辉
导　师: 赵树欣
学　校: 天津科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 高温大曲 PCR-DGGE 细菌群落 16S rDNA
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大曲是指含有大量能发酵的活微生物或酶类的糖化发酵剂。制曲技术是我国特有的一份民族遗产。曲是各种白酒香型风味的重要成因,不同曲中的微生物种类不同,相应白酒的香型也会不同。本论文以高温大曲为研究对象,采用以PCR-DGGE为主的分子生物学方法,初步分析了制曲过程中各主要阶段的细菌菌群的变化,为强化大曲发酵剂的开发提供了理论依据。本论文实验内容主要分为四部分：第一,在提取大曲细菌总DNA过程中,比较了五种基于不同裂解原理的DNA提取方法的效果,发现SDS-酶法结合使用的提取方法,高温大曲中细菌总DNA的提取效率最高,且产量和质量最好,从而为后期实验提供良好的DNA模板。第二,由于实验中采用的引物存在特殊的“GC夹板”结构,本论文对目的基因的PCR扩增方法进行了优化,比较了不同PCR方法的扩增结果,结果显示,采用巢式PCR对16S rDNA V3区进行扩增,不但提高了对目的产物扩增的特异性,同时也使产量得以提高。第三,在预实验中,首先通过垂直胶电泳对DGGE变性浓度梯度范围进行了确定,然后采用时间间隔法选择了最佳电泳时间。结果显示,变性梯度在30%-55%的范围内样品的分离效果最佳,同时确定电泳时间为10h。第四,通过PCR-DGGE技术对制曲过程中细菌的变化进行初步研究,结果表明：在制曲前期优势细菌群落变化较为突出,菌群结构更替频繁,主要优势条带的相似菌有：Bacillus sp. SSCS14-2, Bacillus galactosidilyticus, Virgibacillus carmonensis, Thermoactinomyces sanguinis, uncultured bacterium. Virgibacillus sp. R-6767,其中后三者在制曲中期消失。从中期到后期优势条带相似性较大,菌群群落结构比较稳定,主要优势菌为：Bacillus licheniformis, Virgibacillus carmonensis, Bacillus sp.TAT112, Bacillus galactosidilyticus。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-27
  1.1 高温大曲简述  8-10
    1.1.1 白酒大曲  8
    1.1.2 高温大曲  8-9
    1.1.3 高温大曲生产工艺简介  9
    1.1.4 高温大曲微生物作用  9-10
  1.2 微生物群落结构研究方法综述  10-18
    1.2.1 传统可培养的方法  10-11
    1.2.2 微生物群落水平生理学指纹方法(CLPP)  11
    1.2.3 生物标记方法  11-12
    1.2.4 核酸分析方法  12-17
    1.2.5 元蛋白质组分析  17-18
  1.3 变性梯度凝胶电泳技术简介  18-21
    1.3.1 DGGE的基本原理  18
    1.3.2 DGGE技术的应用工作流程  18-19
    1.3.3 DGGE在微生物生态学研究中的应用  19-21
    1.3.4 DGGE技术的缺陷  21
    1.3.5 DGGE在微生物生态学中的应用前景  21
  1.4 PCR方法简介  21-23
    1.4.1 PCR技术的基本原理  21-22
    1.4.2 不同策略的PCR技术简介  22-23
  1.5 大曲微生物的研究现状及趋势  23-25
    1.5.1 大曲微生物研究现状  23-24
    1.5.2 大曲微生物研究的发展趋势  24-25
  1.6 本论文的研究意义及内容  25-27
    1.6.1 本论文的研究意义  25-26
    1.6.2 本论文的研究内容  26-27
2 材料与方法  27-42
  2.1 实验材料  27-31
    2.1.1 高温大曲  27
    2.1.2 主要药品  27-28
    2.1.3 仪器与设备  28
    2.1.4 主要溶液  28-30
    2.1.5 主要培养基  30-31
  2.2 实验方法  31-42
    2.2.1 高温大曲性质检测  31-32
    2.2.2 高温大曲中细菌总DNA提取方法选择与优化  32-34
    2.2.3 带GC发卡结构的总细菌V3可变区PCR条件的选择与优化  34-37
    2.2.4 DGGE条件的选择与优化  37-39
    2.2.5 DGGE条带的克隆  39-41
    2.2.6 序列测定和系统发育分析  41-42
3 结果与讨论  42-61
  3.1 制曲过程高温曲理化性质的变化  42-43
    3.1.1 细菌含量的变化  42
    3.1.2 糖化力的变化  42-43
    3.1.3 水分含量的变化  43
  3.2 高温大曲中总细菌DNA提取方法的建立  43-46
    3.2.1 不同提取方法对DNA粗提产物质量的影响  43-44
    3.2.2 不同提取方法对DNA粗提物纯度的影响  44-45
    3.2.3 不同提取方法对后期实验适应性的影响  45-46
  3.3 带GC发卡结构的总细菌V3可变区PCR条件的选择与优化  46-51
    3.3.1 常规PCR策略对扩增结果的影响  46-48
    3.3.2 降落式PCR对扩增结果的影响  48
    3.3.3 巢式PCR对扩增结果的影响  48-50
    3.3.4 两种策略对DGGE分析的影响  50-51
  3.4 DGGE条件的选择与优化  51-52
    3.4.1 变性梯度范围的选择  51-52
    3.4.2 DGGE电泳时间的选择  52
  3.5 DGGE分析高温制曲过程中的细菌多样性  52-61
    3.5.1 大曲中细菌总DNA提取结果  52-53
    3.5.2 大曲细菌总16S rDNA V3区巢式PCR扩增结果  53-54
    3.5.3 高温制曲过程DGGE分析  54-55
    3.5.4 DGGE条带的克隆测序结果  55-56
    3.5.5 DGGE条带同源性比较结果  56-58
    3.5.6 系统发育分析  58-61
4 结论  61-62
5 展望  62-63
6 参考文献  63-71
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  71-72
8 致谢  72

应用PCR-DGGE分析高温制曲中细菌群落变化的研究

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