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基于叶绿素荧光成像技术的衰老突变体的筛选与基因克隆

作　者: 赵健
导　师: 宋纯鹏
学　校: 河南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 叶绿素荧光成像 衰老突变体 基因克隆
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


叶片衰老是植物在细胞、组织、器官、机体水平上协同发生的高度受调控的遗传发育过程。叶片衰老在分子水平研究的主要突破点在于研究衰老相关突变体和衰老相关基因，并且从基因水平上鉴定调控因子，包括转录调节子、受体、激素信号调控组分，胁迫应答和代谢相关的调控因子，进而揭示叶衰老过程中调控因子的本质和其高度复杂的信号调控网络。虽然目前对衰老的机制有了初步了解，但仍有许多关键问题需要进一步研究，如衰老细胞死亡机制，细胞、组织、器官和有机体协同调控衰老的机制等。植物衰老的最明显变化就是叶片由绿色变为黄色，叶绿素降解，光合能力减弱。叶绿素荧光成像仪可以直观的检测植物光合能力的变化，进而作为筛选衰老相关突变体的工具。本研究以化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethyl sulfonate，EMS)诱变后拟南芥突变体库为材料，结合叶绿素荧光成像技术筛选并分离衰老相关突变体。通过对拟南芥Col-0整个生长周期叶绿素荧光参数Fv/Fm(PSII反应中心潜在的激发能捕获效率)的观察发现在种子萌发后第28天其数值达到饱和，28天之后Fv/Fm的数值开始减弱，因而确定衰老起始点是种子萌发后第28天。进一步通过对暗处理叶片的荧光数值分析发现，暗处理3天是最佳的筛选实验条件。在上述研究的基础上我们以种子萌发后第28天并加以暗处理三天作为筛选衰老相关突变体的条件，经过大量筛选工作目前共获得14株潜在的突变体，在本研究中我们主要对sef1(senescencefluorescence mutant1，sef1)和sef2进行了详细的生理分析以及初步的基因克隆。sef1突变体Fv/Fm明显低于野生型，进一步研究发现sef1叶绿素降解较野生型快，可溶性蛋白与野生型相比下降较多，离子渗漏比野生型强，RT-PCR表明在突变体中衰老基因上调，通过图位克隆分析，我们初步将其定位于2号染色体。sef2突变体Fv/Fm则明显高于野生型，叶绿素和可溶性蛋白含量较野生型下降缓慢，离子渗漏低与野生型，并且在该突变体中衰老相关基因表达下调，目前将其初步定位于2号染色体。综上所述，我们认为SEF1和SEF2参与了对叶衰老的调控，对其进行生理以及功能分析将有助于我们更好的了解植物衰老的机制。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
缩写词  7-12
1 文献综述  12-24
  1.1 衰老过程中叶绿素的变化  12-13
  1.2 衰老与 PCD 关系  13
  1.3 衰老过程中细胞结构变化和生化变化  13-14
  1.4 影响衰老的因素  14-19
    1.4.1 紫外和臭氧对衰老的影响  14-15
    1.4.2 NO 对衰老的影响  15
    1.4.3 遮蔽和黑暗对衰老的影响  15-16
    1.4.4 糖含量对衰老的影响  16
    1.4.5 氯化钠对衰老的影响  16
    1.4.6 温度对衰老的影响  16
    1.4.7 生长素对衰老的影响  16-17
    1.4.8 SA 对衰老的影响  17
    1.4.9 ABA 对衰老的影响  17
    1.4.10 CK 对衰老的影响  17-18
    1.4.11 乙烯对衰老的影响  18
    1.4.12 JA 对衰老的影响  18-19
    1.4.13 GA 对衰老的影响  19
  1.5 衰老过程中基因表达变化  19-20
  1.6 衰老的研究方法  20-24
    1.6.1 叶片衰老的测定  20-21
    1.6.2 叶绿素荧光成像在叶片衰老研究中的应用  21-24
2 立题依据  24-26
3 材料与方法  26-38
  3.1 常用仪器  26
  3.2 实验材料  26
  3.3 常用试剂及药品  26-27
  3.4 常用溶液及培养基的配制  27-28
    3.4.1 MS 培养基的配制  27
    3.4.2 常用溶液的配制  27-28
  3.5 实验方法  28-38
    3.5.1 拟南芥的栽培  28
    3.5.2 叶绿色荧光各参数的意义  28
    3.5.3 叶绿素含量的测定  28
    3.5.4 可溶性蛋白含量的测定  28-29
    3.5.5 电导率的测定  29
    3.5.6 拟南芥基因组 DNA 的提取  29
    3.5.7 DNA 琼脂糖凝胶的配制  29
    3.5.8 拟南芥的杂交  29-30
    3.5.9 图位克隆  30-34
    3.5.10 重组率的计算  34
    3.5.11 RNA 的提取  34-35
    3.5.12 RNA 反转录成 cDNA  35
    3.5.13 目的基因的克隆  35-38
4 结果与分析  38-50
  4.1 突变体库的构建  38
  4.2 筛选体系构建  38-40
    4.2.1 筛选条件的确立  38-39
    4.2.2 筛选示意图  39-40
    4.2.3 筛选结果  40
  4.3 突变体 sef1 和 sef2 初步研究  40-50
    4.3.1 突变体 sef1 和 sef2 的表型重复  40-41
    4.3.2 突变体 sef1 与 sef2 的生长周期叶绿素荧光的测定  41-42
    4.3.3 突变体 sef1 和 sef2 的叶绿素含量变化  42-43
    4.3.4 突变体 sef1 和 sef2 可溶性蛋白含量变化  43-44
    4.3.5 突变体 sef1 和 sef2 的离子渗漏的测定  44
    4.3.6 突变体 sef1 与 sef2 衰老相关基因的表达分析  44-45
    4.3.7 突变体 sef1 与 sef2 的图位克隆  45-50
5 讨论  50-52
  5.1 筛选体系的分析  50-51
  5.2 对 sef1 和 sef2 的初步分析  51-52
结论  52-54
参考文献  54-64
致谢  64-65

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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